金黄色葡萄球菌肠毒素B的B细胞免疫优势表位及表位疫苗研究

【摘要】研究背景和目的：金黄色葡萄球菌中，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的感染危害严重，目前临床抗生素疗法已法完全控制MRSA感染，疫苗研制迫在眉睫。MRSA致病能力主要取决于其产生的毒素和侵袭酶的能力，金黄色葡萄球菌耐热性肠毒素(SE)，是引起人类食物中毒、全身炎症反应和脓毒症休克的主要原因，其中SEB在MRSA各菌株中序列相对保守，结构稳定。在小鼠模型研究中证实，SEB具有比其他抗原更好的体液应答优势，人SEB单克隆抗体可预防MRSA感染常见的毒性休克综合症。然而，SEB本身为毒素，用于人体存在安全隐患，因此，失去毒性的重组SEB突变子(rSEB)可能是MRSA疫苗良好的候选抗原。研究表明，SEB的免疫保护作用主要来自于抗体应答，而机体的免疫应答多集中针对免疫优势表位，抗原引起的保护性应答实质是特异的保护性表位的应答。因此，对SEB抗原中保护性免疫优势表位的鉴定，是解析MRSA感染中SEB应答的具体机制和优化基于SEB的MRSA疫苗设计的重要前提。目前已报道的SEB的B细胞表位的研究较少，对SEB的免疫优势的B细胞表位的全面分析尚未见报道，基于SEB免疫优势表位的疫苗研究也未见报道。本课题目的是系统筛选并鉴定SEB的B细胞免疫优势表位，并分析相应优势表位的生物学功能；构建并表达涵盖SEB的免疫优势及亚优势B细胞表位的多表位融合蛋白疫苗，并评价其在抗MRSA感染中的保护作用。方法：第一部分：SEB的B细胞免疫优势表位筛选及其功能鉴定1．因SEB毒性与其超抗原活性密切相关，为评价重组SEB突变子(rSEB)的毒性，用不同浓度的rSEB或天然SEB毒素分别刺激BALB/c小鼠脾淋巴细胞，分析rSEB刺激T细胞异常增殖及刺激脾淋巴细胞分泌IL-2，IFN-γ及TNF-α的能力。2．用AlPO4佐剂辅助SEB突变子(rSEB)免疫BALB/c小鼠，在三次免疫之后进行MRSA252菌株的尾静脉攻毒实验，分析rSEB蛋白疫苗在预防MRSA252感染中的效果，并采集rSEB免疫后小鼠的血清，分析血清中SEB抗体效价，评价SEB抗体应答在MRSA感染中的作用。3．合成覆盖SEB全长的42条重叠18-肽，以上步获得的SEB抗血清为一抗，用肽ELISA法分析各个重叠18-肽与SEB的结合能力，系统筛选与SEB具有优势结合能力的线性B细胞表位肽。以SEB全蛋白作为阳性对照，以无关肽OVA192-201和无关蛋白BSA作为阴性对照。用统计学软件SPSS13.0作非配对T检验来分析各个吸光度值。4．在弗氏佐剂辅助下，用免疫优势18-肽-KLH的偶联物免疫BALB/c小鼠，经三次免疫后获得表位肽抗血清。以SEB天然毒素为包被抗原，用间接ELISA法检测不同稀释度的表位特异性抗血清与SEB天然毒素的结合能力。5．针对每个已筛选出的SEB免疫优势表位，从N-端及C-端分别依次截断2个氨基酸，合成多个截断肽，分别以截断肽为包被抗原，以相应优势表位肽抗血清为一抗，用间接ELISA法分析各个截断肽与相应18-肽抗血清的结合强度,明确所筛选表位的核心序列。进一步，表位肽抗血清以不同浓度稀释，再次用ELISA法筛选与相应抗血清结合最强的截断肽，即优势表位核心序列。6．在动物模型中获得表位核心序列的抗血清，在体外进行SEB毒素中和实验，明确所筛选的SEB免疫优势表位的功能。在弗氏佐剂辅助下，用免疫优势表位核心序列-KLH偶联物免疫BALB/c小鼠，经末次免疫后7天获得表位核心序列的抗血清，在体外分析该表位核心序列的抗血清阻断SEB毒素的刺激T细胞增殖及脾淋巴细胞分泌IL-2、IFN-γ及TNF-α的能力。7．在Uniprot蛋白数据库中检索不同金黄色葡萄球菌菌株来源的SEB氨基酸序列，NCBI网站上进行同源性比对，明确所筛选的SEB优势表位在不同金黄色葡萄球菌菌株中的序列保守性。在Pubmedproteindatabase数据库中下载SEB晶体结构图，用PyMOL1.1软件分析SEB免疫优势表位在SEB晶体结构中的位置，分析SEB免疫优势表位在SEB晶体结构中的位置。8．采用肽ELISA法分析SEB优势表位与临床MRSA(+)血清的交叉反应性，以此评价SEB优势表位在人体中的应用前景。以SEB的优势表位为包被抗原以SEB抗血清为阳性对照，以临床SEB抗体(-)血清为阴性对照。第二部分：SEB的多表位疫苗制备及其保护功能评价1．利用基因工程技术构建含SEB优势表位及亚优势表位的疫苗蛋白的原核表达质粒，并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达重组SEB多表位融合蛋白；用SDS-PAGE鉴定蛋白该表达形式；用WesternBlot分析该蛋白的免疫原性及免疫反应性；经离子交换层析纯化该蛋白；对蛋白进行进行N端氨基酸测序；用BCA法检测蛋白浓度。2．分别在弗氏佐剂及AlPO4佐剂辅助下，用SEB多表位蛋白或rSEB免疫BALB/c小鼠，三次免疫后经尾静脉对小鼠进行MRSA252菌株攻毒，分析不同免疫组小鼠在MRSA252感染后14天的生存状态，评价该疫苗对小鼠抗金黄色葡萄球菌感染的保护效果。3．用ELISA法检测小鼠的抗血清滴度，分析各组疫苗免疫后特异性抗体的效价。ELISA法检测SEB多表位疫苗的血清中抗SEBIgG抗体的水平，评价SEB多表位疫苗抗体应答在中和SEB毒素中的作用。分别以疫苗中的各个表位为包被抗原，ELISA法检测疫苗的抗血清与疫苗中每个表位的结合强度，评价疫苗中每个表位特异性抗体的应答水平。4．无菌收集不同免疫组存活小鼠的心、肝、肺及肾脏，研磨获得各脏器组织的悬液，选用生理盐水作不同稀释度稀释，进行细菌涂板，通过菌落计数、革兰染色及PCR法计算各脏器中MRSA252的数量，评价在免疫攻毒后小鼠各脏器中细菌的定植量。结果：第一部分：SEB的B细胞免疫优势表位筛选及其功能鉴定1．SEB突变子(rSEB)失去了SEB天然毒素的超抗原活性，不能刺激T细胞异常增殖，也不能刺激脾淋巴细胞分泌高水平的细胞因子IL-2、IFN-γ及TNF-α。2．用AlPO4佐剂辅助rSEB免疫BALB/c小鼠，获得了预防MRSA252感染的效果，产生了高水平的针对天然SEB的抗体。小鼠存活率达80%，显著高于AlPO4佐剂组(20%)及PBS组(全部死亡)。免疫后血清中SEB抗体平均效价高达1:64000，显著高于AlPO4佐剂组及PBS组。3．在SEB的应答中，IgG抗体应答主要集中针对其中三个免疫优势B细胞18-肽，包括SEB97-114(NKNIDLFGTNYYYQCYFS),SEB205-222(YETGYIKFIEGNGHSFWY)及SEB247-261(VESKSINVEVHLTKK)。其中SEB97–114及SEB247-261分别含有已报道表位SEB252-261(INVEVHLTKK)和SEB96-103(KNKNIDLF)，因此，SEB205-222为本研究新发现的表位。4．与正常血清作对照，SEB的三个优势表位肽特异性抗血清在不同稀释度下，均能高效与SEB天然毒素进行反应(P＜0.05)，尤其在抗血清稀释度为1:1000和1:2000时最显著(P＜0.01)。5．经截断肽ELISA及抗血清的浓度滴定法进一步检测，在SEB97–114组截断肽中，SEB97–112相比其他截断肽与Anti-SEB97–114的结合能力最强；在SEB205–222组截断肽中，SEB205–222相比其他截断肽与Anti-SEB205–222的结合能力最强；在SEB247–261组截断肽中，SEB247–261相比其他截断肽与Anti-SEB247–261的结合能力最强。因此，免疫优势表位SEB97–114、SEB205-222及SEB247-261的核心序列分别为SEB97–112、SEB207-222及SEB247-257。6．在体外，SEB三个免疫优势表位的抗血清Anti-SEB97–114、Anti-SEB205-222及Anti-SEB247-261均可中和天然SEB毒素的刺激T细胞异常增殖及刺激脾淋巴细胞分泌高水平的细胞因子IL-2、IFN-γ及TNF-α的能力。7．同源性分析显示，SEB97–112及SEB207-222氨基酸序列保守，SEB247-257氨基酸序列非保守；三维晶体结构图中显示，SEB97–112位于SEB内部的Loop区，SEB207-222及SEB247-257SEB外部的β-片层。8．SEB97-112与14/14的人MRSA(+)血清有交叉反应，SEB207-222与13/14的人MRSA(+)血清有交叉反应，SEB247-257与14/14的人MRSA(+)血清有交叉反应。第二部分：SEB的多表位疫苗制备及其保护功能评价1．构建并获得了含SEB三个优势表位及三个亚优势表位的SEB多表位融合蛋白。经鉴定，该蛋白为包涵体表达，经纯化后的蛋白纯度大于95%，SEB多表位融合蛋白具有良好的免疫原性及免疫反应性，SEB多表位融合蛋白的N端氨基酸序列与目的蛋白一致。经纯化的SEB多表位融合蛋白浓度为2.924mg/mL。2．分别在弗氏佐剂及AlPO4佐剂辅助下，用SEB多表位融合蛋白疫苗免疫BALB/c小鼠，免疫三次后小鼠获得了对MRSA252的抗感染保护能力。SEB多表位融合蛋白疫苗组的免疫保护效果优于rSEB全抗原组的免疫保护效果，尤其在AlPO4佐剂辅助下，表位疫苗组小鼠抗MRSA252感染的存活率高达100%。3．SEB多表位融合蛋白疫苗诱导小鼠产生了高效价的抗体，特别是在AlPO4佐剂下，SEB多表位融合蛋白疫苗组产生的抗体平均效价高达1:736000。SEB多表位融合蛋白疫苗诱导小鼠产生的抗体能够识别天然SEB毒素，在不同佐剂辅助时，SEB多表位疫苗产生的抗SEBIgG抗体水平有差异。该SEB多表位融合蛋白疫苗诱导小鼠产生的抗体在不同程度上特异性地识别了各个表位，且各个表位的协同可能发挥更好的抗MRSA感染的作用。4．免疫攻毒后，存活小鼠的各个脏器中，肾脏定植的MRSA细菌量显著高于心、肝、肺。经统计学分析，小鼠抗MRSA感染存活率与各个脏器细菌定植量成负相关。结论：本实验通过重叠肽ELISA、B细胞表位特异性抗体的中和毒素活性试验、抗原表位的生物信息学及临床血清学分析，筛选并鉴定出了SEB的三个免疫优势应答B细胞表位，揭示了SEB体液免疫在抗MRSA感染中的保护机制，不仅发现了SEB的新表位SEB207-222，而且揭示了已报道的SEB表位的核心序列SEB97-112及SEB247-257。通过基因工程技术构建并获得了SEB多表位疫苗，进一步通过该疫苗的动物保护实验，并证明了SEB的多表位融合蛋白疫苗具有显著的预防和清除MRSA感染的免疫保护作用，为MRSA疫苗提供了新的研究思路和设计策略
【作者】赵卓；
【导师】邹全明；
【作者基本信息】第三军医大学，微生物与生化药学，2014，博士
【关键词】金黄色葡萄球菌；金黄色葡萄球菌肠毒素B；B细胞免疫优势表位；免疫保护；表位疫苗；

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