急慢性病理条件下Notch通路调控肠粘膜屏障功能的作用及机制研究

【摘要】背景与目的肠粘膜屏障是机体抵御外环境侵袭的的重要屏障。既往大量研究表明：战创伤、烧伤、大型手术等外科应激及炎性肠病(inflammatoryboweldisease,IBD)、全胃肠外营养(totalparenteralnutrition,TPN)等慢性病理刺激均可导致肠粘膜屏障损伤，造成肠源性感染，进一步加重原发疾病，诱发全身炎症反应综合征(SIRS)，导致多脏器功能衰竭(MODS)[1]。尽管目前针对肠粘膜屏障损伤与修复机制做了大量研究工作，但其机制仍未明确。肠上皮形成的机械屏障是维持肠粘膜屏障完整的重要组成部分，其余还包括粘液屏障和免疫屏障。肠道上皮由单层上皮细胞组成，参与肠道中水、电解质和营养物质的吸收，同时抵御肠道中毒素、细菌和各种抗原的入侵。肠上皮是机体内更新最快的组织之一，肠绒毛顶部的上皮细胞由于肠内容物导致的机械损伤等原因迅速的死亡脱落，而肠隐窝部位的干细胞及前体细胞则不断的分裂增殖以补充坏死脱落的上皮细胞，肠上皮细胞可以在4-7天内更新一次，这对于维持肠上皮屏障的完整和肠粘膜的稳态至关重要。在病理条件下如肠缺血再灌注（Intestinalischemiareperfusion,I/R）、小肠大部切除术（Massivesmallbowelresection,MSBR）后，肠粘膜失去正常的稳态平衡，肠上皮屏障的完整性被破坏，可进一步诱发SIRS和MODS。肠道是机体脏器中最容易遭受缺血再灌注损伤的脏器之一，缺血再灌注损伤后肠上皮早期出现坏死和凋亡，肠上皮屏障完整性被破坏，晚期则出现肠上皮的修复再生。既往研究发现，Wnt、TGF-β、BMP、Hedgehog等信号通路均参与了肠I/R损伤肠上皮增殖、凋亡的调控，但是具体机制仍不清楚。短肠综合征(Shortbowelsyndrome，SBS)是常见的临床综合征，主要是由小肠大量切除引起，肠道缺血性坏死是常见原因，主要表现为肠道对水、电解质和营养物质吸收不足，机体出现严重的腹泻、体重降低、脱水和营养不良。为弥补丢失的吸收功能，残余的小肠发生适应性代偿，肠隐窝上皮细胞增殖加速，导致肠绒毛增高，肠隐窝加深，肠上皮吸收面积明显增加，但是肠适应性代偿的机制尚不完全清楚。Notch受体是一种物种间表达高度保守的跨膜蛋白受体，其在胚胎及出生后个体的生长发育中起重要的调节作用。Notch信号通路在肝脏、皮肤、肾脏、心脏、胰腺及支气管上皮等组织器官损伤后的修复再生中发挥重要作用，并可调控肝脏缺血再灌注条件下肝细胞的凋亡。研究发现，Notch信号通路同样密切调控肠上皮细胞的增殖及分化，在肠粘膜稳态的维持中发挥非常重要的调控作用，但是在肠道I/R及MSBR条件下，Notch信号通路在肠上皮细胞增殖、凋亡中的调控作用尚不明确。本课题拟在肠道I/R、MSBR动物模型及体外细胞培养模型中，利用RT-PCR、Western-blot、RNA干扰、激光共聚焦、流式细胞学等技术，观察在肠I/R及MSBR条件下肠上皮中Notch信号通路的表达变化，并探讨Notch信号通路与肠上皮损伤修复之间的内在联系和机制，为肠粘膜屏障功能损害与修复机制提供理论依据，并为肠道缺血再灌注损伤和短肠综合征的临床治疗提供新靶点。方法1、建立鼠肠道I/R动物模型，取肠道标本，免疫组织化学技术及TUNEL染色观察肠上皮细胞增殖、凋亡水平；RT-PCR、蛋白印迹、免疫荧光技术观察Notch信号通路蛋白及mRNA在肠上皮的表达水平。2、建立大鼠小肠隐窝上皮细胞系IEC-6体外培养模型，给予缺氧干预，RT-PCR及蛋白印迹技术观察IEC-6细胞Notch通路蛋白及mRNA表达变化；给予IEC-6细胞Notch受体阻断剂DAPT、RNA干扰技术抑制Notch配体或下游基因的表达，观察IEC-6细胞Notch通路蛋白的表达变化，同时流式细胞学及MTT技术检测细胞增殖、凋亡水平的变化，明确Notch信号通路与肠上皮细胞增殖、凋亡的关系。3、建立大鼠MSBR动物模型，取肠道标本，观察肠粘膜形态学变化；RT-PCR、蛋白印迹及免疫组织化学技术观察肠上皮Notch通路蛋白及mRNA表达变化。4、建立大鼠小肠隐窝上皮细胞系IEC-6体外培养模型，给予重组Notch配体，RT-PCR及蛋白印迹技术观察IEC-6细胞Notch通路蛋白及mRNA表达变化，同时MTT技术检测IEC-6细胞的增殖水平变化，明确MSBR条件下Notch通路表达升高与肠上皮细胞增殖及肠道适应性代偿的关系及机制。主要结果1、大鼠肠道I/R条件下，肠粘膜Jagged2/Notch1/Hes1蛋白及mRNA表达升高，尤其以I/R后2h表达升高最明显，I/R后6h表达基本恢复至对照组水平；免疫荧光结果示Jagged2/Notch1/Hes1蛋白主要定位于肠隐窝部位；PCNA免疫组化结果示：I/R2h肠上皮细胞增殖明显，增殖的肠上皮细胞主要定位于肠隐窝部位。2、体外IEC-6培养模型中，DAPT阻断Notch通路后，NICD1及Hes1蛋白表达水平明显下降，同时MTT结果示：IEC-6细胞增殖水平明显降低；RNAi干扰抑制Jagged2及Hes1表达后，IEC-6细胞增殖水平同样明显降低。3、小鼠肠道I/R（12h）条件下，肠粘膜Jagged1/DLL1/Notch2/Hes5的mRNA表达及NICD2/Hes5蛋白表达均明显升高；同时，TUNEL染色结果示：I/R12h肠上皮细胞凋亡明显增加。4、体外IEC-6培养模型中，DAPT阻断Notch通路后，NICD2及Hes5蛋白表达水平明显下降，流式结果示：DAPT促进了缺氧条件下IEC-6细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率；RNAi干扰抑制Hes5表达，流式结果同样表明：IEC-6细胞的凋亡率明显上升，尤其是早期凋亡率升高明显。5、大鼠MSBR术后，肠粘膜发生适应性代偿，肠绒毛高度增加，隐窝深度加深；肠粘膜Jagged1/Notch1/Hes1蛋白及mRNA水平升高明显；免疫组化结果示：Jagged1/Notch1/Hes1蛋白与PCNA共同定位于肠隐窝上皮细胞，提示Jagged1/Notch1/Hes1通路与肠上皮细胞增殖相关。6、体外IEC-6培养模型中，给予重组Jagged1，IEC-6细胞NICD1及Hes1表达升高，Notch通路被激活，同时IEC-6细胞增殖水平明显升高。结论1、肠I/R损伤后，肠粘膜上皮Jagged2/Notch1/Hes1信号通路被激活，促进了小肠隐窝上皮细胞的增殖，参与了肠粘膜损伤后的修复再生。2、在肠道I/R条件下，肠粘膜上皮Notch2/Hes5信号通路被激活，抑制肠上皮细胞的凋亡，减轻I/R对肠粘膜上皮的损伤，参与I/R条件下肠粘膜上皮的保护作用。3、小肠大部切除术后，肠粘膜上皮Jagged1/Notch1/Hes1信号通路被激活，通路促进小肠隐窝上皮细胞的增殖而参与了MSBR术后肠粘膜的适应性代偿。
【作者】陈国庆；
【导师】杨桦；
【作者基本信息】第三军医大学，外科学（专业学位），2014，博士
【关键词】肠粘膜屏障功能；肠道缺血再灌注；小肠大部切除术；Notch信号通路；肠粘膜上皮细胞；肠适应性代偿；

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