TDRD7单核苷酸多态性与年龄相关性白内障的关联分析及其机制研究

【摘要】研究背景年龄相关性白内障(Age-relatedcataract,ARC)是全球最主要致盲眼病之一[1]，其主要临床表现为晶状体发生混浊，且患者随着年龄增长发生无痛性视力下降。随着人口快速增长和老龄化，ARC患者数量将日趋增加[2]；虽然白内障超声乳化手术能给患者带来较满意视力效果，但不可避免的存在一些术后并发症；同时日益增长手术需求加重了社会经济问题，其巨额支出给国家及社会带来了沉重的医疗经济负担。目前研究认为ARC为典型的多基因疾病，其发生发展与环境及遗传等多种因素相关[3]。真核细胞胞浆中的RNA颗粒被定义为由不同功能mRNA与蛋白质组成的一种亚细胞单位复合体，其在转录后的基因表达调控中起着十分重要的作用[4]。最新研究表明，RNA颗粒成分的TDRD7(Tudordomaincontainingprotein7，TDRD7)基因与白内障的发病机制密切相关，且TDRD7突变会导致众多已知与白内障相关的基因表达发生明显变化。其中与白内障发病机制相关的已知βB3晶状体蛋白(βB3-crystallin，CRYBB3)与小分子热休克蛋白1(smallHeatshockprotein1，HSPB1)可直接与TDRD7相结合。RNA颗粒成分TDRD7对维持晶状体透明功能发挥着重要作用[5],但TDRD7与ARC的遗传易感性及其在晶状体功能中作用具体机制尚未见文献报道。研究目的采取功能候选基因策略在中国汉族人群中对TDRD7基因单核苷酸多态性与ARC易感性进行关联研究，并对ARC易感位点的功能机制进行初步探讨；同时对TDRD7介导的HSPB1/CRYBB3信号通路影响ARC发生的分子机制进行初步研究。研究方法1.利用HAPMAP数据库，结合生物信息学方法挑选具有潜在生物学效应的TDRD7单核苷酸多态性(Singlenucleotidepolymorphism,SNP)位点。2.按照统一的纳入排除标准收集ARC患者及健康自愿者的外周静脉血，抽提基因组DNA；采用SNaPshot方法进行基因分型，分析TDRD7基因单核苷酸多态性在ARC患者及对照组之间基因型、等位基因频率，以及与不同类型不同年龄阶段的ARC发生风险的相关性。3.利用免疫组织化学方法观察人类晶状体TDRD7和HSPB1蛋白表达及定位；利用实时荧光定量PCR方法在RNA水平上对不同年龄不同基因型的皮质性ARC患者晶状体上皮组织TDRD7、HSPB1和CRYBB3表达情况进行探讨。同时采用WesternBlot方法在蛋白水平上观察不同年龄不同基因型的皮质性ARC患者晶状体上皮组织HSPB1和CRYBB3表达变化。研究结果：1.利用HAPMAP数据库结合生物信息学分析在TDRD7基因及其上游7kb调控区域内筛选出5个最小等位基因频率(MinorAlleleFrequency,MAF)大于10%的SNP位点作为研究对象。这5个位点分别为位于外显子诱发错义突变的rs2045732及位于TDRD7上游调控区个的4个SNP位点(rs1462091,rs11793735,rs10981985,rs1462089)。2.在符合纳入排除标准的271例正常健康对照和218例ARC病例中，采用SNaPshot方法对筛选出的5个位点进行基因分型，5个位点在病例及对照中均符合哈温平衡。分析显性、隐性、等位基因遗传模式下各个SNP位点与ARC发生风险相关性，结果提示rs10981985位点多态性与ARC发病风险显著相关。其中rs10981985A等位基因显著减低ARC发生风险(pc=0.01，OR:0.619,95%CI:0.455-0.841),且GA和AA基因型个体ARC患病率显著低于GG基因型个体(pc=0.02，OR:0.561,95%CI:0.388-0.809)。而其余4个位点与ARC发生风险均无显著性差异(pc>0.05)。3.其次在不同类型白内障患者中发现，rs10981985位点多态性与皮质性ARC发病风险相关程度更高，即A等位基因降低皮质性ARC发生风险(pc=0.012，OR:0.502,95%CI:0.315-0.801)，GA和AA基因型个体皮质性ARC发生率显著低于GG基因型个体(pc=0.016，OR:0.431,95%CI:0.251-0.740);此外rs10981985GA和AA基因型个体混合性ARC患病率低于GG基因型个体(pc=0.048，OR:0.433,95%CI:0.235-0.797)。4.以不同年龄层次将样本划分为<65岁及≥65岁两组，观察在显性、隐性、等位基因遗传模式下rs10981985位点单核苷酸多态性与ARC患病风险相关性，结果提示在≥65岁组人群中rs10981985单核苷酸多态性与ARC发病风险显著相关，其中在≥65岁组人群中A等位基因显著减低ARC发生风险(pc=0.004，OR:0.476,95%CI:0.299-0.759),且AA基因型个体在≥65岁组人群中ARC患病风险显著低于GG和GA基因型携带个体(pc=0.016，OR:0.086,95%CI:0.011-0.671)。5.将皮质性ARC患者以不同年龄层次将样本划分为<65岁及≥65岁两组，观察在显性、隐性、等位基因遗传模式下rs10981985位点单核苷酸多态性与皮质性ARC患病风险相关性，结果显示在≥65岁组人群中rs10981985位点单核苷酸多态性与皮质性ARC患病风险显著相关。其中rs10981985A等位基因在≥65岁组人群中显著减低皮质性ARC患病风险(pc=0.004，OR:0.307,95%CI:0.140-0.674),在≥65岁组人群中AA和GA基因型个体皮质性ARC患病风险显著低于GG基因型个体(pc=0.028，OR:0.320,95%CI:0.136-0.755)。6.在人类晶状体上皮组织细胞浆以及晶状体纤维细胞内皮质层TDRD7广泛表达。荧光定量PCR结果显示在皮质性ARC患者晶状体上皮细胞TDRD7的mRNA表达与年龄呈显著线性负相关(r=-0.487，p=0.001)，而将样本依据年龄划分为两组，≥65岁组的皮质性ARC患者晶状体上皮细胞TDRD7的mRNA表达水平显著低于<65岁患者(p=0.019)。在显性、隐性、等位基因型遗传模式下分析rs10981985位点单核苷酸多态性是否影响皮质性ARC患者晶状体上皮细胞TDRD7的mRNA表达，结果提示AA和GA基因型的皮质性ARC患者晶状体上皮细胞TDRD7基因mRNA表达高于GG基因型皮质性ARC患者(p=0.001)。7.HSPB1在人类晶状体上皮细胞浆以及晶状体纤维细胞内皮质层广泛表达。在显性、隐性、等位基因型遗传模式下分析rs10981985位点单核苷酸多态性是否影响皮质性ARC患者晶状体上皮细胞HSPB1的mRNA及蛋白表达，结果显示AA基因型皮质性ARC患者晶状体上皮细胞HSPB1基因mRNA(p=0.006)及蛋白表达(p=0.045)低于携带GG和GA基因型皮质性ARC患者。8.CRYBB3基因在皮质性ARC患者晶状体上皮细胞的mRNA表达与年龄呈线性负相关（r=-0.337，p=0.031）。而将样本依据年龄划分为两组，结果提示<65岁组的晶状体上皮细胞CRYBB3蛋白表达高于≥65岁组表达(p=0.001)。在显性、隐性、等位基因型遗传模式下分析rs10981985位点单核苷酸多态性是否影响皮质性ARC患者晶状体上皮细胞CRYBB3mRNA和蛋白表达，结果显示rs10981985位点未影响皮质性ARC患者晶状体上皮细胞CRYBB3基因mRNA(p>0.05)及蛋白表达(p>0.05)。研究结论：1.TDRD7基因的rs10981985位点单核苷酸多态性在中国重庆地区汉族人群尤其是在≥65岁人群与ARC尤其是皮质性ARC发生风险显著相关，且突变A等位基因为ARC发病的保护因素，其机制可能为起保护效应A等位基因通过维持较高的TDRD7mRNA表达水平从而降低ARC发生风险。2.rs10981985单核苷酸多态性可能通过调节HSPB1表达影响皮质性ARC发病机制。3.TDRD7基因以及其他与白内障发病机制相关的重要基因共同调控HSPB1的表达可能为ARC发生的重要机制之一。
【作者】郑灿；
【导师】叶剑；
【作者基本信息】第三军医大学，眼科学（专业学位），2014，博士
【关键词】年龄相关性白内障；RNA颗粒；Tudor结构蛋白7；单核苷酸多态性；小分子热休克蛋白1；

【参考文献】
[1]苗春云.阿特拉津对非洲爪蟾发育影响的分子毒理学研究[D].济南大学,劳动卫生与环境卫生学,2012,硕士.
[2]柴晓森.应用于免疫检测的电化学传感器研究[D].复旦大学,2011.
[3]陈凌,郭萍,叶长兵.非家族经理进入家族企业研究:以山西票号为例[J].管理世界,2010,12:143-154+188.
[4]陈飞龙.基于偏序关系的快速增量式概念格构建算法[D].西安电子科技大学,计算机软件与理论,2011,硕士.
[5]张辰刚.基于ERP环境的作业成本法在JZ公司的应用研究[D].天津大学,工商管理,2013,硕士.
[6]廖媛媛.不同冻结方式对大黄鱼品质影响的研究[D].宁波大学,水产品加工与贮藏工程,2014,硕士.
[7]冉凡坤.基于HJ卫星的北京市气溶胶光学厚度遥感反演[D].中国地质大学（北京）,地质工程,2014,硕士.
[8]毕丽霞.企业内部环境审计运作模式的研究[D].中国海洋大学,会计学,2003,硕士.
[9]曹鸣辉.microRNA-150和microRNA-495在肿瘤发生中的作用及其机制研究[D].南京大学,生物学,2014,博士.
[10]王焱,郑俊辉,曾家智.一种电力信息网的新型QoS机制[J].电力系统自动化,2007,19:73-75+107.
[11]郭予琦.陕县农业结构调整及其对粮食生产、农民收入的影响研究[D].中国农业大学,作物栽培学与耕作学,2004,硕士.
[12]曹松.特殊精馏分离丙酮—三氯甲烷共沸物的设计与控制[D].华东理工大学,化学工程,2014,硕士.
[13]符晓钰.中国民族音乐国际传播的理论与策略研究[D].湖南师范大学,音乐学,2013,硕士.
[14]孙丽.过滤技术在包钢总排水处理中的应用研究[D].西安建筑科技大学,建筑与土木工程,2004,硕士.
[15]胡卓玮,刘晓旭,彭程,魏铼.基于次序权重平均法的购房选择地理空间多准则决策[J].地理研究,2013,03:476-486.
[16]刘美佳.氮肥对江淮不同年代小麦品种产量品质和氮利用的影响[D].南京农业大学,作物栽培学与耕作学,2012,硕士.
[17]张大鹏.中西医结合治疗重症急性胰腺炎的疗效评价[D].天津医科大学,中西医结合临床,2011,博士.
[18]郭红秀.咪唑类氨基酸功能化离子液体[Hmim][Gly]水溶液吸收CO_2的特性和动力学研究[D].华侨大学,环境工程,2013,硕士.
[19]尹东.余华寺矿区采场稳定性分析及支护方案研究[D].武汉科技大学,采矿工程,2003,硕士.
[20]高伟聪.基于嵌入式系统的电力保护测控装置研制[D].山东大学,电子与通信工程（专业学位）,2012,硕士.
[21]李云山.分布式风力发电交流微网柔性嵌入大电网的控制装置研究[D].河北科技大学,检测技术与自动化装置,2013,硕士.
[22]魏瑞瑞.稠环芳烃分子与单壁碳纳米管之间的相互作用[D].兰州大学,2009.
[23]张茜茜.影响慢加急性肝衰竭患者预后的相关因素研究[D].吉林大学,临床医学,2013,硕士.
[24]李玲.中老年人血清25（OH）D、CRP、IL-6水平与颈动脉内膜中层厚度的相关性分析[D].河北医科大学,内科学,2014,硕士.
[25]易斌,阮氏发.越南语单音节词声调特征的实验统计分析[J].民族语文,2014,03:45-53.
[26]马义明.拉萨地块早白垩世火山岩古地磁学和年代学研究对亚洲南缘的古地理限制[D].中国地质大学（北京）,构造地质学,2013,硕士.
[27]陈春辉.咳喘宁对哮喘大鼠肺组织趋化素样因子1表达的影响[D].湖南中医药大学,中医儿科学（专业学位）,2014,硕士.
[28]丁芳.乌蒙山区草地畜牧业问题及对策[D].兰州大学,草业科学,2013,硕士.
[29]于孟虎.集资诈骗罪司法认定若干问题研究[D].吉林大学,法律,2013,硕士.
[30]洪荣文.新课程改革中对历史创新教育的探析[D].福建师范大学,教育,2003,硕士.
[31]屈志坚,刘明光,李娜,杨罡,王松.环形拓扑快速追踪优化算法[J].电力系统自动化,2009,21:43-47+86.
[32]姜君.锂离子电池串并联成组优化研究[D].北京交通大学,2013.
[33]边青.基于PXA320的WiFi手持终端的研究与开发[D].陕西科技大学,模式识别与智能系统,2013,硕士.
[34]员苗.张金吾与《爱日精庐藏书志》[D].内蒙古师范大学,历史文献学,2013,硕士.
[35]许淑梅,王金铎,于建国,韩文功,崔殿,翟玉兰.济阳拗陷桩海地区下古生界深埋藏溶蚀特征及储集意义[J].石油地球物理勘探,2007,05:591-596+610+487-488.
[36]刘洋.恩格斯晚年书信对唯物史观的贡献[D].苏州大学,马克思主义基本原理,2013,硕士.
[37]秦虎.枣庄市文化产业发展中的政府作用研究[D].山东师范大学,公共管理（专业学位）,2013,硕士.
[38]赵亮.布鲁氏菌rOmp31_(48-74)-BLS重组载体的构建与苜蓿的转化[D].内蒙古科技大学,生物化学与分子生物学,2014,硕士.
[39]杨槿梅.用电市场景气状况分析方法的研究[D].清华大学,2004.
[40]陈彬,于继来.电力网络源流路径链的双向电气剖分算法[J].电力系统自动化,2011,18:41-46.
[41]皋军.基于模糊理论的数据挖掘技术的研究与应用[D].南京航空航天大学,2004.
[42]张瑛鹉.民办中学教师情绪智力、工作满意度与教学效能感的相关研究[D].河北师范大学,应用心理,2013,硕士.
[43]谢业鹏.钢筋钢纤维混凝土梁弯曲疲劳性能试验研究[D].内蒙古工业大学,结构工程,2013,硕士.
[44]李冰.石家庄市社区养老服务问题及对策研究[D].河北师范大学,公共管理,2014,硕士.
[45]安锦.西部地区新牧区建设研究——以内蒙古为例[J].贵州民族研究,2014,10:45-48.
[46]邓杨周.英语专业大学生专业承诺、学习倦怠与英语成绩之间的关系[D].湖北大学,课程与教学论,2012,硕士.
[47]王栋.新型毒蕈碱型M1受体激动剂的发现及其在Alzheimer症动物模型中的评价[D].华东师范大学,基因组学,2012,博士.
[48]孙太雨.民国时期社会教育法规研究（1912-1945）[D].沈阳师范大学,教育史,2013,硕士.
[49]葛春艳,赵晓磊.高考试题中有关N_A题的常设陷阱[J].中学化学,2014,05:25-26.
[50]覃宝钢.汉字创意字体设计及应用研究[D].北京印刷学院,设计艺术学,2013,硕士.