GOD和STZ对胰岛β细胞损伤作用及腹腔镜胃旁路术治疗2型糖尿病的临床分析

【摘要】背景和目的糖尿病已成为全球流行病，其发病率正逐年增高且常伴有各种并发症，严重威胁着人类健康。成人糖尿病患者中以2型糖尿病最为多见，主要是因为机体内胰岛素产生不足和/或胰岛素抵抗所致的葡萄糖代谢紊乱而引起血糖升高。糖尿病发病机制复杂，如较高浓度的食品添加剂葡萄糖氧化酶也能诱导胰岛素抵抗，最终导致糖尿病。葡萄糖氧化酶是葡萄糖代谢途径中的关键酶，通过催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢(H2O2)，在糖尿病发病机理中起着重要作用。在已有的报道中，葡萄糖氧化酶显示对多种细胞具有凋亡诱导作用，包括胰岛β细胞，神经元细胞和成纤维细胞。其作用机理与它的H2O2生成有关。然而，更深入的毒理性机制未见报道。为更好的解析糖尿病发病机制，人们构建糖尿病动物模型进行相关研究。链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)是最常用来诱导构建糖尿病动物模型的药物之一，对胰岛β细胞有选择性毒性作用。在试验性糖尿病模型中，不同的STZ处理方式诱导不同类型的糖尿病反应。目前，2型糖尿病多是基于改变生活方式的药物治疗，但远期疗效都差强人意。近些年来，国内外大量的临床研究证实，外科手术能有效治疗糖尿病。本研究旨在：1)更深入探讨葡萄糖氧化酶对胰岛β细胞的毒性机制，为葡萄糖氧化酶诱发胰岛素抵抗的机理提供更多的支持证据。2)比较多次低剂量STZ(MLD)和单次高剂量STZ(SHD)对细胞内ROS生成和胰岛β细胞超微结构的影响，为STZ诱导构建糖尿病动物模型中的应用提供进一步的理论支持。3)探讨腹腔镜胃空肠Roux-en-Y转流术对2型糖尿病的临床疗效，以及评估手术的安全性。实验方法1)用葡萄糖氧化酶处理胰岛β细胞RIN-m5F细胞。用MTT法观察葡萄糖氧化酶对细胞活性的影响。用DCFH荧光法显示细胞内活性氧自由基(reactiveoxygenspecies，ROS)水平。用流式细胞仪观察细胞凋亡和细胞周期。用透射电镜观察亚细胞结构。用实时定量RT-PCR观察线粒体融合蛋白的表达。2)高脂喂养的大鼠给予腹腔多次低剂量STZ注射(MLD，30mg/kg.d，共3天)或单次高剂量STZ注射(SHD，120mg/kg)。最后一次注射后禁食12h，取动脉血和胰腺。血清胰岛素用ELISA测量，羟自由基和H2O2用化学光谱法检测。胰岛β细胞超微结构用电镜观察。3)回顾性分析我院近2年来接受腹腔镜LRYGB手术治疗的33例2型糖尿病(T2DM)患者临床资料。分析患者手术前，手术后1个月，3个月和6个月的体重指数，腰围，口服糖耐量(OGTT)试验，C肽、胰岛素释放试验，以及糖化血红蛋白和血脂的变化。术后12个月随访观察BMI、腹围、空腹血糖、HbA1c等指标。实验结果1)葡萄糖氧化酶剂量依赖性地降低细胞活性。相反，葡萄糖氧化酶剂量依赖性地增加细胞内ROS及细胞凋亡。在亚细胞结构上，葡萄糖氧化酶严重损伤线粒体，表现为线粒体数量减少、体积缩小、线粒体融合和分裂。进一步的结果显示葡萄糖氧化酶显著诱导线粒体融合蛋白Mfn1，Mfn2和Opa1的表达。2)与正常饮食大鼠相比，MLD和SHD大鼠禁食血糖均显著升高，以MLD更甚。MLD大鼠胰岛素水平显著升高，胰岛素敏感指数明显下降，而SHD大鼠胰岛素水平未见改变，胰岛素敏感指数仅轻微下降。MLD和SHD处理均引起胰岛β细胞线粒体肿胀。然而MLD显著减少线粒体数量，SHD仅中度减少线粒体量。在ROS水平观察上，MLD显著升高羟自由基和H2O2水平，而SHD没有显著的影响。3)33例患者均顺利恢复，无死亡，其中3例患者(占9%)术后并发吻合口漏(1例)和吻合口溃疡(2例)，经保守治愈均得以恢复。与术前相比，术后1，3，6个月，体重指数，腰围，糖化血红蛋白，总胆固醇和甘油三酯，空腹血糖，空腹血清胰岛素和C-肽均明显降低(P<0.05)。术后12个月患者体重指数、腹围、HbA1c等指标仍然维持低水平。在OGTT试验中，术后1，3，6个月血糖值在60，120，180min时相较术前显著下降。C肽和胰岛素释放试验中，术后1，3和6个月胰岛素和C肽分泌峰值前移。所有这些变化，均以术后6个月最为显著。在随访满1年的18例患者中，糖尿病病情缓解11例(61.1%)，血糖控制5例(27.8%)，好转2例(11.1%)，无效0例。结论1)葡萄糖氧化酶对胰岛β细胞具有强烈的毒性作用。其毒性机理涉及细胞内H2O2积累。增加的细胞内H2O2进一步损伤线粒体，从而诱发线粒体性细胞凋亡。2)相对于SHD单纯的胰岛β细胞毒性，MLD显示一个更严重的双重糖尿病诱导作用，即损伤胰岛β细胞和诱导胰岛素抵抗，ROS积累可能起重要作用。3)不同剂量和次数的STZ均能破坏β细胞，降低胰岛素的释放。并能诱导严重的空腹血糖和胰岛素水平升高，甘油三酯上升，且增加ROS水平，造成胰岛β细胞线粒体损伤。4)腹腔镜胃空肠LRYGB旁路术，可以有效地改善2型糖尿病患者的糖代谢和胰岛素分泌，是2型糖尿病的有效治疗。5)腹腔镜胃空肠LRYGB旁路术，对T2DM的近期疗效满意，88.9%的患者达到T2DM缓解或血糖控制，手术安全，值得临床推广。
【作者】高羽；
【导师】刘宝华；
【作者基本信息】第三军医大学，外科学（专业学位），2014，博士
【关键词】2型糖尿病；胰岛素；胰岛β细胞；胰岛素抵抗；葡糖氧化酶；氧自由基；凋亡；线粒体；链脲霉素；腹腔镜Roux-en-Y胃空肠转流术；

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