电针任督脉和人脐血MSCs移植对脑缺血大鼠保护研究

【摘要】缺血性脑血管疾病中医称为缺血性中风,约占所有脑血管疾病病人的70-80%,不单给患者自己带来巨大的痛苦,也给社会与家庭带来沉重的包袱。因此,预防缺血性脑卒中后神经损伤和激发受损神经再生成为现阶段探讨的热点。目前,间充质干细胞(MSCs)移植为脑缺血治疗提供前沿思路,具备良好的临床应用前景,然而其具体的作用机制尚未明确。移植后的MSCs可能通过促转分化为神经样细胞、促进宿主细胞分泌功能、减轻局部炎症反应及抑制细胞凋亡等来恢复其神经功能缺损症状。针刺任督脉经穴治疗缺血性脑卒中已有一定的临床基础。前期研究的结果表明,电针任督脉穴位可较长久促进局灶性脑缺血模型大鼠脑内内源性神经干细胞复制分化为神经元。同时,电针任脉穴位能较明显上调脑内神经生长因子蛋白的表达,电针督脉穴位能抑制神经细胞凋亡,从而有利于促进脑缺血后神经功能的恢复。因此,MSCs移植和针刺治疗缺血性脑卒中机理可能相似。基于以上研究情况,我们提出以下假说,跟单纯MSCs移植相比,电针任督脉联合MSCs移植能更好拮抗脑缺血再灌注损伤。本课题以人脐血MSCs移植联合针刺为切入点,从文献研究和实验研究两部分,通过提取培养人脐血MSCs和建立大鼠脑缺血再灌注模型,深入研究电针任督脉经穴联合人脐血MSCs移植治疗脑缺血的可能机制。1、目的：通过成功提取、培养并鉴定人脐血MSCs并将其移植到脑缺血再灌注大鼠脑内,观察脑缺血大鼠人脐血MSCs移植后移植部位附近的细胞结构,同时观察其VEGF蛋白的表达和TUNEL染色阳性细胞数量情况,以及分别电针任督脉经穴和电针督脉经穴后对细胞结构、VEGF表达、细胞凋亡和神经功能症状等的作用,以期揭示任督脉电针联合MSCs移植治疗脑梗塞的可能机制,为未来针灸联合干细胞移植治疗脑卒中提供理论和实验依据。2、方法：2.1人脐血MSCs的体外培养和生物学特性研究在产妇以及家属知情情况下,无菌采集广州中医药大学附属深圳市中医院产科健康育龄产妇分娩胎儿的脐血17份,用密度梯度离心法对脐血单个核细胞(MNCs)进行分离后,以1×106个/cm2密度接种在优质胎牛血清(FBS)预包被的T75培养瓶中,后添加含10%FBS、谷氨酰胺、表皮生长因子、碱性成纤维生长因子和青霉素／链霉素等的DMEM/F12培养基20m1,将培养瓶置于37℃、饱和湿度、体积分数为5%C02的培养箱中培养,1周后全量换液,去除未贴壁细胞,后每3-4天全量换液。等细胞长到约80%-90%时,消化后按照3000个/cm2接种至细胞培养瓶进行传代培养,共传3代。移植前用PBS洗涤细胞3次,0.4%苔盼蓝检测细胞活力,调终浓度至1×105/μl备用。分别取P0和P3代的人脐血MSCs,运用流式细胞仪检测培养细胞的免疫表型CD90、CD73、CD105、CD44、CD29、CD45、CD34、CD19、CD14和HLA-DR的表达。取部分P3代的人脐血MSCs,连续12天进行细胞生长曲线测定。2.2电针任督脉经穴联合人脐血MSCs移植对脑缺血大鼠的干预机制研究SPF级成年健康雄性SD大鼠120只,随机分为假手术组、PBS移植组、人脐血MSCs移植组、电针督脉+人脐血MSCs移植组和电针任督脉+人脐血MSCs移植组。每组再分别随机分成7天组、14天组和28天组,每亚组各8只。运用线栓法造成动物右侧局灶性脑缺血再灌注模型。造模24小时后,人脐血MSCs移植组和联合电针组都予以大鼠右侧纹状体和皮层下人脐血MSCs移植,PBS移植组于相同部位以等量的PBS注射。联合电针组在人脐血MSCs移植手术24小时后于任脉(承浆、气海、关元)和督脉(大椎、百会、水沟)行电针治疗,采用疏密波刺激(疏波30Hz,密波100Hz),强度6-15V,作用20min,每天1次直到老鼠处死为止。假手术组和PBS移植组在手术24小时后固定在动物固定台上20min,不进行任何治疗。各组大鼠按实验设计时间处死、取脑。运用改良的神经功能缺损评分(mNSS)评估每组大鼠神经功能缺损情况；运用HE染色观察各组动物移植部位附近的病理形态学改变；运用免疫组化方法对移植区域附近VEGF阳性细胞进行标记；运用TUNEL法观察移植区域附近脑组织细胞凋亡情况。利用德国LeiCaDCSoftware数码图像分析系统软件包行图像分析。200倍光镜下行阳性细胞计数,利用SPSS15.0软件行统计分析,对比各组间差异。3、结果：3.1本实验共分离培养17份脐血,成功培养出人脐血MSCs4份,成功率高达到23.5%。当MNCs加入培养基及生长因子进行培养后,显微镜下观察约3-7天即可见少量形态各异的贴壁细胞,培养瓶内含有大量悬浮的粒细胞。当贴壁细胞增殖到一定量时进行全量换液,此后约换液2-5次细胞融合度可达到80%以上,可见成纤维细胞样克隆形成和形态相对均一的梭形细胞,呈漩涡状生长或放射状生长。传代后细胞显著加快其生长速度,于接种后第4-5天其生长趋势最为明显,数目显著增加。第5、6天,细胞铺满培养瓶底,连接成片状。整个原代培养需时约为15-30天,此后每传1代约需4-5天。流式鉴定结果显示,P0和P3代细胞均表达CD90、CD73、CD105、CD44和CD29,不表达造血系细胞表面标记CD45、CD34、CD19或CD14,对组织相容性免疫表型的分析显示人脐血MSCs不表达HLA-DR抗原。3.2与假手术组大鼠对比,其余组动物经成功造模后,都表现出一定程度神经功能缺损症状,如不能彻底伸展左前肢、向左侧转圈、向左侧倾倒、不能自行行走且意识程度降低等。PBS移植组、人脐血MSCs移植组、督脉联合人脐血MSCs移植组和任督脉联合人脐血MSCs移植组随着时间的延长,其mNSS评分均有不同程度减少趋势。7天时评分最高,14天时明显减少(P<0.01),28天时其mNSS评分最低,较14天相比差异显著(P<0.01)。再灌注7天和14天,人脐血MSCs移植组的mNSS评分低于PBS移植组(P<0.05),而督脉联合人脐血MSCs移植组和任督脉联合人脐血MSCs移植组的mNSS评分分别低于人脐血MSCs移植组(P<0.01),而7天、14天和28天的督脉联合人脐血MSCs移植组的mNSS评分与同时相的任督脉联合人脐血MSCs移植组没有统计学差异(P>0.05)。3.3缺血再灌注后,缺血灶边缘区可出现明显的脑组织水肿、神经细胞变性坏死等变化,表明采用线栓法制作大鼠脑缺血再灌注模型是可行的。与单纯人脐血MSCs移植比较,电针任督脉经穴联合人脐血MSCs移植或电针督脉经穴联合人脐血MSCs移植能够在一定程度上减轻缺血再灌注损伤。3.4免疫组化结果表明,脑缺血再灌注损伤后,缺血灶边缘区VEGF可出现应激性上调,但是该上调在某种程度上具有时限性,随着血流再灌时段的延长,VEGF的阳性表达出现下落趋势,再灌7天,其表达最强,阳性细胞最多,再灌14天表达减弱,数目减少,至再灌28天时阳性细胞数目最少。跟单纯人脐血MSCs移植比较,电针任督脉经穴联合人脐血MSCs移植或电针督脉联合人脐血MSCs移植至少能在再灌注14天后上调VEGF蛋白的表达,且联合任督脉电针比联合督脉电针在上调VEGF蛋白表达方面效果更佳。3.5TUNEL结果显示,脑缺血后,缺血灶边缘区可出现TUNEL阳性细胞,随着血流再灌时段的延长,其阳性表达出现下落趋势,再灌7天,其表达最高,阳性细胞最多,再灌14天阳性表达减弱,数目减少,至再灌注28天阳性细胞数目最少。跟单纯人脐血MSCs移植比较,电针任督脉经穴联合人脐血MSCs移植或电针督脉联合人脐血MSCs移植至少能在再灌注7天后下降TUNEL染色阳性细胞数量,且联合任督脉电针比联合督脉电针在下降TUNEL染色阳性细胞数量方面效果更佳。4、结论人脐血中确实存在MSCs且高度表达MSCs表面特异性抗原标记。跟单纯人脐血MSCs移植比较,电针任督脉联合人脐血MSCs移植或电针督脉联合人脐血MSCs移植能够更好上调缺血灶边缘区VEGF蛋白的表达,下降TUNEL染色阳性细胞数量,促进神经功能缺损恢复并明显改善其局部病理结构,从而更好促进脑缺血后的神经保护和损伤修复。
【作者】陈鹏典；
【导师】杨卓欣；
【作者基本信息】广州中医药大学，针灸推拿学，2014，博士
【关键词】电针；任督脉；脑缺血；人脐血；MSCs；

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