石菖蒲成分β-细辛醚对帕金森病模型大鼠作用的自噬机制研究

【摘要】β-细辛醚是从中药石菖蒲提取的主要有效成分,它具有广泛的药理作用,特别是在中枢神经系统方面的作用较为显著。课题组前期发现β-细辛醚能显著改善脑缺血再灌注损伤,同时能够改善老年痴呆体外细胞模型β-淀粉样蛋白诱导的细胞损伤,而且我们观察到β-细辛醚能够通过调控自噬通路来发挥保护作用。自噬作为第二种程序性死亡方式,与神经退行性疾病有着密切联系,是当前生物科学的热点研究方向。但是β-细辛醚对帕金森病模型大鼠的行为学和神经递质是否有改善作用?β-细辛醚是否能够通过影响自噬而保护受损的帕金森病多巴胺神经元?其作用机理是如何?目前,国内外还没有见到相关的报道。本实验主要由四个部分组成,第一部分：以6-OHDA模型大鼠为对象,分别研究自噬蛋白Beclin1在纹状体、皮层、海马三个区域以及酪氨酸羟化酶(TH)在纹状体和中脑的动态变化；第二部分：以6-OHDA模型大鼠为对象,研究单胺类神经递质在脑内纹状体、皮层、海马三个区域的动态变化；第三部分：研究β-细辛醚对6-OHDA模型大鼠的行为学、单胺类神经递质、TH、α-突触核蛋白(a-syn)以及自噬的影响,探究其药效学基础。第四部分：基于JNK/Bcl-2通路探讨β-细辛醚改善帕金森病损伤的作用,并探究β-细辛醚调节自噬的具体机理。第一部分实验目的：报道已证实Beclin1在帕金森病(PD)模型中发挥重要作用,比如在敲除Beclin1基因的小鼠中发现多巴胺神经元的死亡、多巴胺合成减少、a-syn聚集增多。TH是左旋多巴合成为多巴胺过程中一种重要的限速酶,它的表达与脑内中多巴胺神经元和多巴胺的水平成正比。但自噬蛋白Beclin1在PD模型大鼠脑内纹状体、皮质、海马的动态表达情况以及TH在中脑和纹状体的动态表达情况仍然未知?另外,Beclin1和TH两者之间的关系如何?目前国内外还未见报道。本阶段的实验目的是分别考察Beclin1和TH在各自不同部位的动态表达及其两者之间的相关性。方法：本实验采用立体定位注射6-OHDA大鼠来模拟PD模型。将70只SD大鼠分为7组,每组10只,分别为阴性对照组、3h、6h、12h、24h、48h、72h模型组。阴性对照组注射6uL生理盐水；各模型组左侧的前脑内侧束(MFB)注射6-OHDA6μL(24μg)；分别造模至相应时间取脑组织,流式细胞测定纹状体、海马、皮质中Beclin1的表达,免疫组化检测中脑和纹状体中TH的含量,探讨Beclin1和TH在PD模型中不同部位的动态变化以及两者之间的关系。结果：1.三区域Beclin1动态表达情况：海马区：Beclin1的表达在3小时升高,在24小时达到高峰,随后Beclin1的表达缓慢下降,直到72小时达到稳定。与24小时模型组中Beclin1的表达比较,其他的组别Beclin1的表达均显著下降。皮质区和纹状体区：Beclin1的表达也在3小时升高,在12小时时达到高峰,随后Beclin1的表达缓慢下降,直到72小时达到稳定。与12小时模型组中Beclin1的表达比较,其他的组别Beclin1的表达均显著下降。这些数据表明Beclin1在不同部位中发挥了不同作用。2.两区域TH动态表达情况：在中脑和纹状体中,TH在3到12小时之间明显下降,但是在24到72小时之间其表达缓慢下降。3.Beclin1和TH在不同部位之间表达差异：Beclin1表达的差异：在12小时模型组中,纹状体和皮质中Beclin1的表达明显高于其在海马中的表达。在24小时模型组中,海马中Beclin1表达明显高于其在皮质中的表达。Beclin1在其他组别中三个部位间并无明显差异。TH表达的差异：中脑TH表达在12和24小时模型组中明显低于其在纹状体中的表达。但是在其他组别中两个部位间并无明显差异。4.Beclin1和TH表达之间的关系：Pearson相关分析显示,在0到12小时之间,Beclin1和TH表达之间具有明显的负相关,但是在12到72小时之间,两者之间具有明显的正相关。结论：1.Beclin1在纹状体、皮质、海马的动态表达：纹状体和皮质的Beclin1动态表达情况类似,均在3小时候升高,在12小时时达到高峰。但是在海马区,Beclin1的表达在24小时达到高峰。2.两区域TH动态表达情况：在中脑和纹状体中TH动态表达情况类似。3.Beclin1在不同部位之间表达差异：结果显示只有在高峰的时间,不同部位的Beclin1表达才具有差异。4.Beclin1和TH表达之间的关系：在0到12小时之间,Beclin1和TH表达之间具有明显的负相关,但是在12到72小时之间,两者之间具有明显的正相关。第二部分实验目的：报道已经证实在PD模型中单胺类神经递质含量降低,PD的行为学症状肌肉僵直、运动迟缓、震颤与多巴胺及其代谢物的下降有关。越来越多的报道显示PD还会出现非行为学的症状,比方说嗅觉失常,焦虑症,失眠症等。5-羟色胺(5-HT)、5-羟基吲哚乙酸(5-HIAA)以及去甲肾上腺素(NE)的缺失会引起PD非行为学的症状。但是多巴胺(DA)、高香草酸(HVA)、5-HT、5-HIAA以及NE五种神经递质在早期PD模型脑内纹状体、皮层、海马三个区域的动态情况如何?几种神经递质者之间的关系如何?目前国内外还未见报道。本阶段的实验目的是研究单胺类神经递质在PD模型脑内三个部位的动态变化。方法：本实验采用立体定位注射6-OHDA大鼠来模拟PD模型。将SD大鼠分为7组,每组10只,分别为阴性对照组、3h、6h、12h、24h、48h、72h模型组。阴性对照组注射6μL生理盐水；各模型组左侧MFB注射6-OHDA体积6μL(24μg);分别造模至相应时间取纹状体、皮层、海马三个区域的脑组织,采用HPLC方法同时检测DA、HVA.5-HT、5-HIAA以及NE的含量,并用Pearson相关分析神经递质之间的关系。结果：1.五种神经递质在三个不同部位动态表达情况：纹状体：当6-OHDA注射后,纹状体中DA水平在3至12小时之间迅速下降,而且在12至72小时继续下降。但是纹状体中HVA水平在3至12小时之间保持稳定,而在12到24小时之间下降明显。纹状体中的5-HT和5-HIAA水平在3至72小时之间保持着直线下降,但是NE水平在3至48小时之间缓慢下降,而在48至72小时之间上升到正常水平。海马：当6-OHDA注射后,海马中DA和HVA水平在3至24小时之间缓慢下降,而在24至48小时保持稳定,与纹状体中DA和HVA的变化有着显著区别。海马中5-HT水平在3到6小时之间下降明显,而在6至72小时之间缓慢下降。但是海马中的5-HIAA在3至12小时之间缓慢下降,而在12至48小时下降较为明显,直到检测不到。NE水平在3至48小时之间缓慢下降,而在48至72小时上升到正常水平。皮质：当6-OHDA注射后,皮质中DA和HVA在3至24小时之间缓慢下降,而在24至48小时保持稳定,变化趋势与海马相似。皮质中5-GT、5-HIAA以及NE变化与海马相似。5-HT水平也在3到6小时之间下降明显,而在6至72小时之间缓慢下降。5-HIAA也在3至12小时之间缓慢下降,而在12至48小时下降较为明显,直到检测不到。NE水平在3至48小时之间缓慢下降,而在48至72小时上升到正常水平。2.神经递质在三个不同部位之间的关系：Pearson相关分析显示,在纹状体,皮质和海马三个部位中,DA与5-HT具有较好正相关,但是海马中NE与三个部位中DA之间具有较好的负相关。结论：1.6-OHDA注射到大鼠MFB后,纹状体、皮质和海马中五种神经递质在3小时后就就开始下降,一直持续到72小时。2.相关性分析显示：在纹状体、皮质和海马三个部位中,DA与5-HT具有较好正相关,但是海马中NE与三个部位中DA之间具有较好的负相关。第三部分实验目的：课题组前期发现β-细辛醚能显著改善脑缺血再灌注损伤,同时能够改善老年痴呆体外细胞模型的β-淀粉样蛋白诱导的细胞损伤。但是β-细辛醚对PD模型大鼠的行为学和神经递质是否有改善作用?是否能通过影响自噬而发挥对PD模型大鼠的作用?目前国内外未见报道。本阶段目的是研究β-细辛醚对PD模型大鼠行为学、纹状体内单胺类神经递质、α-syn以及TH的影响,探明β-细辛醚对PD模型大鼠的药效作用基础。方法：本阶段实验选用立体定位注射6-OHDA大鼠来模拟PD模型。将SD大鼠随机分为6个组,每组10只：假手术组、模型组、β-细辛醚高剂量组(40mg/kg)、β-细辛醚中剂量组(20mg/kg)、p-细辛醚低剂量组(10mg/kg),阳性药物组(美多巴,75mg/kg)。除假手术组外,其余组均行立体定位注射6-OHDA大鼠。实验前后分别用自由活动度、滚轴实验以及前肢运动功能检测动物的行为学变化,最后采用大脑灌注,排除血液,断头取脑,分别取大脑的皮质、海马、纹状体等部位,HPLC检测单胺类神经递质的含量；ELISA检测α-syn含量；免疫组化检测TH含量变化；免疫蛋白印迹检测Beclin1,LC3B的变化；电镜观察自噬体的变化。结果：1.β-细辛醚对6-OHDA模型大鼠行为学的影响：与模型组大鼠的自主活动计数和滚轴实验比较,给予β-细辛醚高、中、低剂量后,其自主活动计数和平衡能力明显增高。在β-细辛醚的高、中、低剂量中,低剂量组(10mg/kg)大鼠在自主活动计数表现较好。与正常组大鼠的前肢启动时间(IT)以及步伐时间(ST)比较,模型组大鼠IT以及ST均上升。与模型组大鼠的IT以及ST实验比较,给予β-细辛醚高、中、低剂量后,其IT以及ST均显著性降低。而且在β-细辛醚的高、中、低剂量中,各组剂量大鼠在IT以及ST实验中并无显著性差异。2.β-细辛醚对6-OHDA模型大鼠单胺类神经递质的影响：与正常组比较,模型组单胺类神经递质均显著下降。模型组大鼠给予β-细辛醚高、中、低剂量后,其脑内DA和5-HT含量无明显差异。但是β-细辛醚高、中、低剂量均能升高模型组中HVA、3,4-二羟苯基-乙酸(Dopacl)、5-HIAA含量。而且β-细辛醚的高、中、低剂量对HVA、Dopacl和5-HIAA含量无明显差异。3.p-细辛醚对6-OHDA模型大鼠α-syn以及TH含量的影响：与正常组比较,模型组脑内的α-syn显著上升。模型组大鼠给予β-细辛醚高、中、低剂量后,能够显著降低a-syn的含量。而且在β-细辛醚的高、中、低剂量中,各组剂量大鼠在降低a-syn的含量中变现并无显著性差异。与正常组比较,模型组中的TH含量显著下降。模型组大鼠给予β-细辛醚高、中、低剂量后,能够显著提高TH含量,但是β-细辛醚的高、中、低剂量对TH含量并无显著性差异。4.β-细辛醚对6-OHDA模型大鼠中自噬的影响与正常组比较,模型组的Beclin1和LC-3B蛋白表达显著上升。模型组大鼠给予β-细辛醚高、中、低剂量后,能够显著降低Beclin1和LC-3B蛋白表达。在β-细辛醚的高、中、低剂量中,低剂量组(10mg/kg)降低Beclin1和LC-3B蛋白的表达表现较好。而且我们用电镜观察正常组、模型组、β-细辛醚低剂量、自噬激活剂以及抑制剂组,发现上述相同的结果。结论：1.β-细辛醚改善PD模型大鼠的行为学。2.β-细辛醚能升高纹状体中HVA、Dopacl以及5-HIAA的含量。3.β-细辛醚能降低中脑内a-syn含量,并能够升高中脑部位的TH表达。4.β-细辛醚能降低中脑内Beclin1和LC-3B蛋白表达,且低剂量作用显著,提示其可能影响自噬来发挥作用。从行为学、神经递质、TH以、a-syn以及自噬五个方面证实β-细辛醚对PD模型的药效学。第四部分实验目的：前一阶段实验数据表明,β-细辛醚从行为学、神经递质、TH以、a-syn以及自噬五个方面对PD模型发挥保护作用,但是β-细辛醚如何调控自噬来发挥对PD的保护作用?本阶段重点研究β-细辛醚减轻6-OHDA损伤可能的自噬机制。课题组前期观察到β-细辛醚能提高老年大鼠c-Jun基因的表达,而且能影响JNK/Bcl-2通路改善大鼠缺血再灌注引起的损伤。因此,我们推测β-细辛醚可能通过影响JNK、p-JNK、Bcl-2以及Beclin1的表达来减轻6-OHDA对多巴胺神经元的损伤。方法：本阶段实验选用立体定位注射6-OHDA大鼠来模拟PD模型。将SD大鼠随机分为3个组,每组10只,包括模型组、β-细辛醚组、JNK抑制剂组。除假手术组外,其余组大鼠均进行立体定位注射6-OHDA。最后采用大脑灌注,排除血液,断头取脑,分别检测各标本中Beclin1、JNK、p-JNK以及Bcl-2的含量。结果：1.β-细辛醚和JNK抑制剂对Beclin1、Bcl-2、JNK和p-JNK的影响：对比模型组而言,给予JNK和β-细辛醚后,其脑内的Beclin1、JNK和p-JNK含量均显著下降,但是在JNK抑制剂和β-细辛醚组别中Bcl-2的含量显著上升。结论：在6-OHDA模型大鼠中,β-细辛醚调节自噬的分子机制可能与JNK、p-JNK、Bcl-2以及Beclin1有关。β-细辛醚可能先通过降低JNK以及p-JNK的表达,进而提高了Bcl-2的表达,使Bcl-2与Beclin1的结合增强,最终导致Beclin1表达下降,从而有可能降低自噬的水平。总结论：首先,我们用6-OHDA模型研究了Beclin1以及TH在不同部位的动态表达,结果显示在造模后的不同时间段,Beclin1的表达具有差异,提示Beclin1介导的自噬可能参与帕金森病发病过程。其次,我们还利用6-OHDA模型研究DA.HVA.5-HT.5-HIAA以及NE在不同部位中的动态表达,结果提示在纹状体、皮质以及海马三个部位中,五种神经递质均受到影响,而且变化规律有所差异,相关性分析显示DA与5-HT之间具有较好的正相关,但DA与NE之间有较好的负相关,提示神经递质之间能相互影响。然后,我们从行为学、神经递质、TH、a-syn和自噬五个方面证实β-细辛醚能够减轻PD模型损伤的作用,而且发现β-细辛醚能够抑制自噬的发生,提示其可能通过调控自噬来发挥作用。最后,在6-OHDA模型大鼠中,以JNK抑制剂为对照,研究p-细辛醚对Beclin1、Bcl-2、JNK和P-JNK的影响。结果显示β-细辛醚可能通过降低JNK以及p-JNK的表达,进而提高了Bcl-2的表达,使Bcl-2与Beclin1的结合增强,最终导致Beclin1表达下降,从而有可能降低自噬的水平。
【作者】张升；
【导师】方永奇；
【作者基本信息】广州中医药大学，中西医结合基础，2014，博士
【关键词】帕金森病；β-细辛醚；自噬；Beclin1；酪氨酸羟化酶；单胺类神经递质；

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