Toll样受体拮抗剂中药对缺血性心血管病的作用与机制

【摘要】目的：心肌缺血再灌注损伤(MIR)是冠状动脉相关疾病发病率和死亡率的主要原因。其特点是快速增加的细胞因子、趋化因子和白细胞大量涌入脆弱的梗塞部位危险区。这种炎症反应不仅在急性期导致心肌细胞凋亡,也导致了不利的心肌重塑并进一步损伤心脏功能。动脉粥样硬化(AS)是动脉管壁的一种慢性炎症性疾病,也是缺血性心脏病发病率与病死率的首要原因。其特点是循环脂质部分沉积于受损的血管壁的内皮下间隙,引起修饰后的脂蛋白、固有血管细胞和免疫系统之间的复杂的相互作用,并最终导致动脉粥样硬化斑块的破裂与缺血性心脏病为主的临床并发症的形成。中国草本药物(中药),特别是活血化瘀类中药及其配伍的中药方剂,在中国传统医学中广泛应用于心肌梗死等心血管疾病的治疗已数百年。虽然中药疗效有据可查,但其潜在的分子机制仍不清楚,因而进行此研究,以期为联系中医药的实验研究与临床应用搭建有益的桥梁。方法：我们由文献整理了新近研究中100余种中药提取化合物、单味中药或中药配方对心肌缺血再灌注损伤及动脉粥样硬化的细胞和分子机制。由于缺血再灌注损伤与动脉粥样硬化的共同特征,均包含细胞因子、趋化因子和炎性细胞浸润、心脏组织与动脉管壁固有细胞的死亡等病理过程,且Toll样受体(TLR)2和4均可介导这些过程；因而,我们针对活血化瘀类中药三棱的提取化合物SParstoloninB(SsnB),一种新的TLR2/4选择性拮抗剂,分析了其通过抑制TLR2/4介导的炎症反应对缺氧复氧损伤的心肌细胞及大鼠心肌组织、以及动脉粥样硬化病理条件下主动脉平滑肌细胞的影响及相关机制。本研究主要应用细胞分子生物化学及免疫组织化学方法：(1)乳酸脱氢酶(LDH)测定法用于评价中药提取化合物对细胞活性的毒性影响,(2)直接细胞计数法与[3H]掺入法用于测定细胞增殖能力,(3)划痕愈合测定法和Transwell小室测定法用于评价细胞迁移水平,(4)实时定量PCR检测用于评价目标基因的mRNA表达水平,(5)酶联免疫吸附剂测定法(ELISA)用于检测细胞外低水平蛋白的表达量,(6)免疫印迹测定法(Westernblot)用于检测细胞内目的蛋白及细胞信号转导分子的表达水平,(7)细胞内胆固醇试剂盒用于检测细胞内胆固醇水平,(8)末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)染色用于检测细胞的凋亡水平,(9)高碘酸-希夫(PAS)染色用于检测发生早期坏死的细胞水平,(10)油红0染色用于评估细胞内脂质的沉积水平。成果：首先,文献研究结果,一方面表明,中药改善心肌缺血再灌注损伤的机制,主要包括：(1)抗氧化应激,(2)抗炎症反应,(3)抗细胞凋亡,(4)保护线粒体功能,(5)提高骨髓基质干细胞迁移,(6)促进血管生成,(7)上调KATP通道亚基和ATP酶活性,并抑制钙超载。另一方面表明,中药改善动脉粥样硬化的机制,主要包括：(1)保护血管内皮,(2)降低低密度脂蛋白内皮下沉积,(3)抑制低密度脂蛋白氧化,(4)抑制单核细胞的迁移和激活,(5)抑制血管平滑肌细胞的迁移和增殖,(6)减少泡沫细胞形成,(7)抑制慢性炎症反应。其次,心肌细胞实验结果表明：(1)乳酸脱氢酶(LDH)检测表明适用浓度的SsnB对H9c2心肌细胞无细胞毒性,因此10μM的SsnB被用于后续实验。(2)实时定量PCR检测结果证实,TLR2和TLR4的mRNA表达在缺氧复氧刺激后心肌细胞中均升高,而SsnB可抑制其上调,差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)无论qPCR显示的mRNA水平,还是酶联免疫吸附剂测定法(ELISA)显示的蛋白水平,单核细胞趋化蛋白1(MCP1)及高迁移率族1(HMGB1)都在缺氧与复氧后上调,并被SsnB抑制,差异具有统计学意义(P<0.05)。(4)胞外信号调节激酶(ERK)1/2和C-Jun氨基末端激酶(JNK)细胞信号转导途径在缺氧复氧中被活化,其后可被SsnB抑制,并呈现剂量依赖性效应,差异具有统计学意义(P<0.05)。(5)Transwell细胞迁移实验表明,小鼠腹腔来源的巨噬细胞向缺氧复氧损伤的心肌细胞的迁移能力,可被SsnB降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。再次,大鼠心肌组织实验结果表明：(1)培养基中LDH水平反映适用浓度的SsnB对缺氧损伤的大鼠心肌组织无细胞毒性,因此15μM及30μM的SsnB被用于后续实验。(2)SsnB可降低缺氧诱导的大鼠心肌组织切片中LDH的释放,并呈现剂量依赖性效应,差异具有统计学意义(P<0.05),并呈剂量依赖性作用。(3)末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)染色和高碘酸-希夫(PAS)染色结果分别显示,SsnB可保护缺氧诱导的大鼠心肌组织切片并降低细胞凋亡,差异具有统计学意义(P<0.05),并可保护缺氧诱导的大鼠心肌组织切片及降低细胞坏死,差异具有统计学意义(P<0.05)。(4)实时定量PCR检测证实,MCP1和IL-6的mRNA表达在缺氧时均升高,而SsnB可抑制其上调,差异具有统计学意义(P<0.05)。最后,大鼠主动脉的血管平滑肌细胞实验结果表明：(1)乳酸脱氢酶测定法进行测定的结果表明,适用浓度的SsnB对血管平滑肌细胞无细胞毒性作用,因此3μM,10μM及30μM的SsnB被用于后续实验。(2)采用直接细胞计数法、乳酸脱氢酶测定法、[3H]胸苷掺入法分别对血管平滑肌细胞的增殖进行测定,结果表明SsnB可抑制血管平滑肌细胞的增殖,并呈现剂量依赖性效应,且差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)采用划痕愈合测定法和Transwell小室测定法分别对血管平滑肌细胞的迁移活性进行测定,结果表明SsnB可抑制血管平滑肌细胞的迁移,降低细胞迁移距离、减少迁移细胞面积,并呈现剂量依赖性效应,且差异具有统计学意义(P<0.05)。(4)实时定量PCR检测结果证实,对于炎性分子,MCP1、IL-6和TNF-α,在脂多糖/血小板衍生生长因子刺激下均出现升高,而SsnB均可降低其表达,且差异具有统计学意义(P<0.05)。(5)采用免疫印迹法Westernblot对细胞信号通路的蛋白表达进行测定,结果表明,胞外信号调节激酶ERK1/2和Akt信号通路均可被脂多糖/血小板衍生生长因子刺激所激活,而两者均可被SsnB抑制,且差异具有统计学意义(P<0.05)。(6)有趣的是,我们发现,采用细胞内胆固醇试剂盒测定的结果表明,血管平滑肌细胞内的胆固醇水平可被乙酰化低密度脂蛋白(AC-LDL)诱导而升高,且被SsnB抑制,且差异具有统计学意义(P<0.05)。进而,采用油红0染色进行确认,结果显示SsnB可降低油红0染色的阳性区域,即细胞内的脂滴积累。同时,Westernblot检测表明,ATP结合膜盒转运体A1(ABCA1)可被乙酰化低密度脂蛋白(AC-LDL)及脂多糖诱导而下调,SsnB可恢复其水平,从而促进细胞内的胆固醇流出,且差异具有统计学意义(P<0.05)；实时定量RT-PCR结果显示,CD36的表达水平被乙酰化低密度脂蛋白/脂多糖的刺激上调后,可被SsnB抑制；而ABCA1的表达水平被乙酰化低密度脂蛋白(AC-LDL)及脂多糖诱导而下调后,可被SsnB恢复,且差异具有统计学意义(P<0.05)。结论：我们的数据表明,活血化瘀类中药三棱的提取化合物SsnB作为一种新的选择性TLR2和TLR4拮抗剂,(1)可以减少缺氧复氧诱导的心肌细胞的TLR2与TLR4表达,抑制TLR介导的下游炎症反应,降低相关炎症因子的合成与释放,抑制巨噬细胞等炎症细胞向缺血坏死区域的募集,且其作用与抑制胞外信号调节激酶ERKl/2和C-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路相关。(2)SsnB通过抑制缺乏循环炎性细胞浸润的心肌细胞的自身炎症反应,降低相关炎症因子的表达,减少缺氧诱导的心肌组织细胞的坏死与凋亡,对缺氧损伤的大鼠左心室(LV)培养组织具有保护作用。(3)同时,SsnB可以通过抑制胞外信号调节激酶ERK1/2和Akt信号通路的活化,减轻动脉粥样硬化的形成与进展中的血管平滑肌细胞的增殖、迁移、炎症反应与脂质沉积。(4)因此,SsnB具有发展成为一种用于防治缺血再灌注损伤与动脉粥样硬化在内的缺血性心血管疾病的新型治疗剂的潜力。这些研究将为弥合中国传统本草药物之谜和现代细胞分子生物学之间的鸿沟搭建新的桥梁。
【作者】刘擎；
【导师】罗翌；
【作者基本信息】广州中医药大学，中西医结合临床，2014，博士
【关键词】心肌缺血再灌注损伤(MIR)；SparstoloninB(SsnB)；Toll样受体(TLR)；炎症反应；凋亡与坏死；

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