扶正抗癌方对吉非替尼治疗晚期非小细胞肺癌的增效研究

【摘要】目的：1.临床部分：采用回顾性病例匹配队列研究的方法,研究组为吉非替尼联合扶正抗癌方,对照组为吉非替尼单药,观察两组的疾病无进展生存期及总生存期,了解吉非替尼联合扶正抗癌方组的无进展生存期及中位生存期是否优于吉非替尼单药组。2.实验部分：在裸鼠右腋下接种对吉非替尼低度耐药的H1650细胞株,建立获得性耐药非小细胞肺癌裸鼠皮下移植瘤模型,进行胃内给药,了解两药能否协同抑制肿瘤生长,从而验证中医药对靶向药物是否具有增效作用,并探索其分子机制。方法：1.临床部分：采用回顾性病例匹配队列研究的方法,配对50组以上Ⅲb-Ⅳ期非小细胞肺癌患者,分成治疗组及对照组。治疗组接受吉非替尼联合扶正抗癌方(扶正抗癌方,250mlbidpo+吉非替尼250mgqdpo),连续服至病情进展或不能耐受毒副反应。对照组接受吉非替尼单药治疗(吉非替尼250mgqdpo),服药至疾病进展。治疗前及之后每6周复查胸部CT评价疗效。首要终点为疾病无进展生存时间(PFS)；次要终点为中位生存期(MST)、客观反应率(ORR)及毒性反应。2.实验部分：在60只裸鼠右腋下接种对吉非替尼耐药的细胞株(H1650细胞株),造模成功后进行随机分组,每组10只,分组如下：空白对照组(0.9%生理盐水)、吉非替尼组(5g/m1)、中药低剂量组(扶正抗癌方：6.2g/m1)、中药高剂量组(扶正抗癌方：12.4g/m1)、吉非替尼联合中药低剂量组(吉非替尼：5g/ml,扶正抗癌方：6.2g/m1)、吉非替尼联合中药高剂量组(吉非替尼：5g/m1,扶正抗癌方：12.4g/ml),然后进行胃内给药。给药结束后,对裸鼠转移瘤体积进行测量。观察不同组别的裸鼠肿瘤体积、抑瘤率,并对瘤体及靶器官进行切片观察,检测微管密度、增殖指数,Tunel法检测凋亡指数,用免疫组化法检测EGFR、ERK、AKT及其磷酸化蛋白表达。结果：1.临床方面：1.1患者配对：自2007年7月1日至2012年12月31日,共纳入患者159例,其中于广东省中医院肿瘤科门诊或于广东省中医院肿瘤科住院接受吉非替尼联合扶正抗癌方治疗的非小细胞肺癌患者100例,广东省人民医院接受单纯吉非替尼治疗患者59例。以性别、年龄段、吸烟状态、PS评分及病理因素为配对因子进行配对。具体配对因素如下：同性别、年龄(同年龄段：30-39岁,40-49岁,50-59岁,60-69岁,70-79岁)、分期、同吸烟状态(无；有)、同病理、PS评分一致。配对成功58对,1例因年龄小(患者年龄为27岁)而无法配对成功。116例患者中,接受吉非替尼治疗58例,吉非替尼联合扶正抗癌方58例。吉非替尼组患者EGFR状态大部分已明确,EGFR基因突变率(18、20、21外显子突变,19外显子缺失)为74.1%；而吉非替尼联合扶正抗癌方组大部分未知,其中明确者突变率为10.3%。两组均有EGFR基因非突变患者,吉非替尼组4例(6.9%),吉非替尼联合扶正抗癌方组5例(8.6%)。1.2疾病无进展生存期截至末次随访时间,对整体人群进行分析发现,吉非替尼组的中位无进展生存时间是11.43个月,而吉非替尼联合扶正抗癌方组是13.1个月,二者差异具有统计学意义(P=0.013)。一线治疗时,吉非替尼组的中位疾病无进展生存时间是11.43个月,扶正抗癌方联合吉非替尼组是12.33个月,二者差异有统计学意义(P=O.024)。亚组分析发现：以EGFR基因进行分层分析发现,EGFR基因突变(19外显子缺失或21外显子突变)患者,吉非替尼组的疾病中位无进展生存时间是11.80个月,吉非替尼联合扶正抗癌方组是25.20个月,二者差异有统计学意义(P=O.016)；根据性别进行分层分析发现,在女性患者,吉非替尼组的疾病中位无进展生存时间是11.43个月,吉非替尼联合扶正抗癌方组是12.00个月,二者差异有统计学意义(P=0.009)；以吸烟情况进行分层分析发现,对于不吸烟患者,吉非替尼组的疾病中位无进展生存时间是11.80个月,吉非替尼联合扶正抗癌方组是13.10个月,二者差异有统计学意义(P=O.007)；以病理类型进行分层分析发现：对于腺癌患者,吉非替尼组的疾病中位无进展生存时间是11.80个月,吉非替尼联合扶正抗癌方组是13.10个月,二者差异有统计学意义(P=0.022)。1.3总生存期截至末次随访时间,吉非替尼组的中位生存时间是18.7个月,而吉非替尼联合扶正抗癌方组是22.83个月,二者生存差异具有统计学意义(P=O.049)。亚组分析发现：以EGFR基因进行分层分析发现,EGFR基因未明患者,吉非替尼组的中位生存时间是20.27个月,吉非替尼联合扶正抗癌方组是23.73个月,二者生存差异具有统计学意义(P=0.018)；根据性别进行分层分析发现：在女性患者,吉非替尼组的中位生存时间是18.70个月,吉非替尼联合扶正抗癌方组是23.73个月,二者差异有统计学意义(P=0.027)；以吸烟情况进行分层分析发现：对于不吸烟患者,吉非替尼组的中位生存时间是18.87个月,吉非替尼联合扶正抗癌方组是23.73个月,二者差异有统计学意义(P=0.044)；以病理类型进行分层分析发现：对于腺癌患者,吉非替尼组的中位生存时间是18.87个月,吉非替尼联合扶正抗癌方组是22.83个月,二者差异无统计学意义(P=0.065)。1.4客观反应率接受单纯吉非替尼组的客观反应率(CR+PR)为82.76%,而接受吉非替尼联合扶正抗癌方的客观反应率为(CR+PR)为74.14%,组间差异无统计学差异(P=0.527)。1.5不良反应最常见的不良反应是皮疹及腹泻,其次是口腔黏膜炎及转氨酶升高。吉非替尼组皮疹的发生率为41.38%,吉非替尼联合扶正抗癌方组的皮疹发生率为24.14%,组间差异具有统计学差异(P=0.048)。2.实验研究方面2.1不同给药组对裸鼠H1650移植瘤模型瘤体体积及瘤重的影响与空白组比较,吉非替尼联合中药低剂量组及中药高剂量组的瘤体体积差异有统计学意义(P<0.01)。与吉非替尼组比较,吉非替尼联合中药(扶正抗癌方)低剂量组的瘤体体积差异有统计学意义(P=0.001),吉非替尼联合中药高剂量组的瘤体体积差异有统计学意义(P=1.53E-4)；与中药低剂量组比较,吉非替尼联合中药低剂量组的瘤体体积差异有统计学意义(P=4.99E-4)；与中药高剂量组比较,吉非替尼联合中药高剂量组的瘤体体积差异有统计学意义(P=1.53E-4)。实验结束后,与对照组比较,吉非替尼联合中药高剂量组的瘤重明显下降,差异有显著统计学意义(P<0.01),其他各组之间的差异无统计学意义。2.2不同给药组对裸鼠H1650移植瘤细胞增殖的抑制作用经Ki67染色后,增殖细胞的细胞核呈棕黄色。细胞增殖率依次为空白组(63.94±8.19)%、吉非替尼组(57.11±7.58)%、中药低剂量组(54.39±8.85)%、中药高剂量组(55.94±12.26)%、吉非替尼联合中药低剂量组(50.61±8.81)%及吉非替尼联合中药高剂量组(48.72±11.63)%,细胞增殖呈下降趋势,与空白组比较,组间差异有统计学意义。与吉非替尼组比,吉非替尼联合中药(扶正抗癌方)低剂量组、吉非替尼联合中药高剂量组的细胞增殖率差异有统计学意义(P<0.05)。与中药高剂量组,吉非替尼联合中药高剂量组细胞增殖率差异有统计学意义(P=0.029)。2.3不同给药组对裸鼠H1650移植瘤细胞凋亡的诱导作用细胞凋亡率依次为空白组(13.00±7.86)%、吉非替尼组(16.30±9.06)%、中药低剂量组(19.00±7.75)%、中药高剂量组(18.50±5.36)%、吉非替尼联合中药低剂量组(26.00±3.46)%及吉非替尼联合中药高剂量组(26.70±16.50)%,细胞凋亡呈上升趋势。与空白组比较,吉非替尼联合中药低剂量组、吉非替尼联合中药高剂量组的细胞凋亡率差异有统计学意义(P<0.05)。与吉非替尼组比较,吉非替尼联合中药(扶正抗癌方)低剂量组、吉非替尼联合中药高剂量组的细胞凋亡率差异有统计学意义(P<0.05)。与中药低剂量组,吉非替尼联合中药低剂量组细胞凋亡率差异有统计学意义(P<0.05)。2.4不同给药组对裸鼠H1650移植瘤微血管密度影响微血管密度依次为空白组(16.40±3.10)、吉非替尼组(7.20±2.15)、中药低剂量组(10.40±2.80)、中药高剂量组(8.00±1.33)、吉非替尼联合中药低剂量组(8.60±1.58)及吉非替尼联合中药高剂量组(6.40±2.46),肿瘤微血管密度呈下降趋势。与空白组相比,不同给药组对移植瘤微血管密度影响组间差异有统计学意义(P<0.001)。2.5不同给药组对AKT、EGFR、ERK、p-EGFR及p-ERK表达影响AKT表达的平均密度依次为空白组(0.327±0.024)、吉非替尼组(0.234±0.026)、中药低剂量组(0.275±0.020)、中药高剂量组(0.301±0.041)、吉非替尼联合中药低剂量组(0.292±0.024)及吉非替尼联合中药高剂量组(0.288±0.047)。与空白组比较,不同给药组的AKT表达的平均密度均降低,组间差异有统计学意义(P<0.001)；与吉非替尼组比较,吉非替尼联合中药(扶正抗癌方)低剂量组、吉非替尼联合中药高剂量组的平均密度差异有统计学意义(P<0.001)。EGFR表达的平均密度依次为空白组(0.367±0.042)、吉非替尼组(0.34±0.038)、中药低剂量组(0.318±0.038)、中药高剂量组(0.326±0.041)、吉非替尼联合中药低剂量组(0.341±0.042)及吉非替尼联合中药高剂量组(0.327±0.015),组间差异无统计学意义。ERK表达的平均密度依次为空白组(0.362±0.025)、吉非替尼组(0.312±0.019)、中药低剂量组(0.305±0.024)、中药高剂量组(0.300±0.005)、吉非替尼联合中药低剂量组(0.336±0.037)及吉非替尼联合中药高剂量组(0.327±0.015)。与空白组比较,不同给药组的ERK表达的平均密度均降低,组间差异有统计学意义(P<0.001)；与吉非替尼组比较,吉非替尼联合中药(扶正抗癌方)高剂量组的平均密度降低,组间差异有统计学意义(P=0.001);与中药高剂量组比较,吉非替尼联合中药高剂量组的平均密度降低,组间差异有统计学意义(P=0.019)。p-AKT表达的平均密度依次为空白组(0.334±0.026)、吉非替尼组(0.289±0.084)、中药低剂量组(0.282±0.075)、中药高剂量组(0.317±0.078)、吉非替尼联合中药低剂量组(0.311±0.078)及吉非替尼联合中药高剂量组(0.280±0.078),组间差异无统计学意义。p-EGFR表达的平均密度依次为空白组(0.364±0.053)、吉非替尼组(0.372±0.010)、中药低剂量组(0.287±0.034)、中药高剂量组(0.292±0.051)、吉非替尼联合中药低剂量组(0.281±0.052)及吉非替尼联合中药高剂量组(0.281±0.051),组间差异有统计学意义。与空白组比较,不同给药组的p-EGFR表达的平均密度均降低,组间差异有统计学意义(P<0.05)。p-ERK表达的平均密度依次为空白组(0.336±0.033)、吉非替尼组(0.291±0.022)、中药低剂量组(0.237±0.014)、中药高剂量组(0.308±0.023)、吉非替尼联合中药低剂量组(0.243±0.018)及吉非替尼联合中药高剂量组(0.217±0.018)。与空白组比较,吉非替尼组、中药低剂量组、吉非替尼联合中药低剂量组及吉非替尼联合中药高剂量组的p-ERK表达的平均密度均降低,组间差异有统计学意义(P<0.05)。与吉非替尼组比较,吉非替尼联合中药(扶正抗癌方)低剂量组、吉非替尼联合中药高剂量组的平均密度差异有统计学意义(P<0.001)；与中药高剂量组比较,吉非替尼联合中药高剂量组的平均密度降低,组间差异有统计学意义(P<0.001)。结论：1.临床研究：1.1吉非替尼联合扶正抗癌方组在整体人群的疾病无进展时间及中位生存时间较单纯吉非替尼组长,提示扶正抗癌方对吉非替尼有增效作用。1.2吉非替尼联合中药扶正抗癌方治疗晚期非小细胞肺癌的客观反应率与吉非替尼单药相似,联合治疗组皮疹发生率低于吉非替尼单药组,提示扶正抗癌方对吉非替尼有减毒作用。2.实验研究：2.1吉非替尼联合扶正抗癌方对裸鼠非小细胞肺癌H1650移植瘤的抑制优于吉非替尼单药或单纯中药(扶正抗癌方)治疗,高剂量扶正抗癌方联合吉非替尼的作用最佳。2.2吉非替尼联合扶正抗癌方对H1650移植瘤细胞增殖的抑制优于单纯吉非替尼或单纯扶正抗癌方治疗；两药联合诱导H1650移植瘤细胞凋亡也优于吉非替尼或扶正抗癌方治疗。2.3扶正抗癌方、吉非替尼及二者联合均能抑制肿瘤血管生成。2.4扶正抗癌方及吉非替尼能下调p-EGFR、AKT、ERK及p-ERK表达,联合用药对AKT、ERK及p-ERK表达下调优于单纯扶正抗癌方或吉非替尼。2.5扶正抗癌方是通过下调AKT、ERK及p-ERK表达而达到对吉非替尼的增效作用。
【作者】杨小兵；
【导师】吴万垠；
【作者基本信息】广州中医药大学，中医内科学（专业学位），2014，博士
【关键词】扶正抗癌方；吉非替尼；非小细胞肺癌；增效作用；

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