卵巢功能减退的临床影响因素与实验研究

【摘要】目的：1、分析肾虚肝郁型DOR患者的生命质量现状及其影响因素,为肾虚肝郁DOR的预防保健提供科学依据,为肾虚肝郁DOR的治疗提供新的思路和方法。2、确定CTX致大鼠卵巢功能损害模型建模成功。3、观察加减归肾丸对环磷酰胺所致卵巢功能减退大鼠卵巢功能的影响。方法：1、选择2012年10月——2013年10月,于广州中医药大学第一附属医院妇科门诊、广东省第二中医院妇科门诊就诊,符合纳入标准者50例作为观察组。选择同期来我院体检的月经正常的,年龄在18-40岁之间的健康妇女50例作为健康对照组。观察组及健康对照组均采用统一信息登记表,专人面对面详细询问病史,并填写《健康测量量表SF-36))。以分析肾虚肝郁型DOR患者的生命质量现状及其影响因素。2、预试验(1)参照刘惠芬等造模方法予CTX75mg/kg腹腔单次注射,确定照模成功。(2)将48只SD雌性大鼠随机分为空白对照组、模型组、中药组,每组均于用药后1、2、3、4周每日观察大鼠动情周期,每周每组处死4只大鼠,称取卵巢重量、进行卵巢组织形态学观察及卵泡计数、测定血清E2、FSH,评估卵巢储备功能,观察大鼠卵巢功能恢复情况。3、加减归肾丸对环磷酰胺所致卵巢功能减退大鼠卵巢功能的影响(1)参照刘惠芬等造模方法予CTX75mg/kg腹腔单次注射造模。(2)大鼠造模1周后眼眶静脉丛取血分离血清测定E2、FSH水平,取造模成功大鼠40只随机分为5组,分别为空白对照组、模型组、中药高、中、低剂量组、西药对照组,每组8只。中药各剂量组及西药对照组大鼠按剂量灌胃给药,l0ml/kg,每天1次,连续4周,空白对照组、模型组大鼠给予等体积蒸馏水。(3)各组大鼠均于用药4周内每日观察大鼠动情周期,给药4周结束后各组大鼠取血测定血清E2、FSH、LH、AMH、INHB,称取卵巢重量,进行卵巢组织形态学观察及卵泡计数,免疫组化测定VEGF、GDF-9表达,评估卵巢储备功能,观察大鼠卵巢功能恢复情况。结果：1、肾虚肝郁型DOR患者的生命质量及影响因素分析(1)两组妇女身高、体重、BMI比较,差异无统计学意义(P>0.05)。(2)熬夜、吸烟、饮酒的人数在观察组中明显高于健康对照组,经常锻炼的人数在观察组中明显低于健康对照组,经统计学比较有显著性差异(P<0.05)；精神紧张、长期抑郁、遭受重大刺激、易生气的人数在观察组中明显高于健康对照组,经统计学比较有显著性差异(P<0.05)；感觉压力大、经常出差、大专以上的人数在观察组中明显高于健康对照组,与同事关系融洽的人数在观察组中明显低于健康对照组,经统计学比较有显著性差异(P<0.05)。(3)两组妇女生存质量状况比较：SF-36总体健康评分在观察组为711.41±18.91分,在健康对照组为1068.57±30.77分,经统计学比较有显著性差异(P<0.05)；生理健康评分、心理健康评分在观察组妇女明显低于健康对照组妇女,经统计学比较,有显著性差异(P<0.05)；PF、RP、BP、GH、VT、SF、RE、MH在观察组妇女明显低于健康对照组妇女,经统计学比较,有显著性差异(P<0.05)。2、预试验(1)大鼠一般情况空白对照组大鼠外观体征、行为活动、精神状态、摄食、饮水、被毛、呼吸、口、眼、鼻、耳、大小便形状颜色等均正常。模型组大鼠被毛疏松,活动减少,精神不振,四肢无力。中药组大鼠外观体征、行为活动、精神状态、摄食、饮水等于空白对照组大鼠无明显异常,被毛、呼吸、口、眼、鼻、耳、大小便形状颜色等均属正常。(2)对动情周期的影响空白对照组所有的大鼠阴道涂片均有规则的动情周期变化,周期为4-6d,中位数为5d。模型组大鼠在CTX注射后第1、2周阴道涂片显示动情周期发生改变,规则的动情周期变化消失,延长为8-17d,中位数为1ld。阴道涂片显示分泌物少,有较多散在的白细胞,少量上皮细胞,部分有少量的角化细胞和有核细胞,动情间期时间为5-7d。中药组大鼠在CTX注射后第1、2周阴道涂片显示动情周期也发生改变,规则的动情周期变化延长,为6-12d,中位数为9d。阴道涂片显示有少量散在白细胞,少量上皮细胞,少量的角化细胞和有核细胞,动情间期时间为2-4d。(3)对卵巢功能减退大鼠血清中E2、FSH水平的影响血清E2水平在模型组大鼠于2w、3w、4w时显著降低,与空白对照组比较有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。在中药组大鼠于3w、4w时显著升高,与模型组比较有显著性差异(P<0.05)。血清FSH水平在模型组大鼠于1w、2w、3w、4w时显著升高,与空白对照组比较有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。在中药组大鼠于1w、2w、3w、4w时均显著降低,与模型组比较有显著性差异(P<0.05)。(4)对卵巢功能减退大鼠卵巢指数的影响卵巢指数在模型组大鼠于2w、3w、4w时显著减小(P<0.05或P<0.01),与空白对照组比较有显著性差异。卵巢指数在中药组大鼠于1w、2w、3w、4w时均有一定程度升高,与模型组比较无显著性差异(P>0.05)。(5)对卵巢功能减退大鼠卵泡数目的影响原始卵泡数在模型组大鼠于1w、2w、3w、4w时均显著减少,与空白对照组比较有显著性差异(P<0.01)；在中药组大鼠于1w、2w、3w、4w时均明显增多,与模型组比较有显著性差异(P<0.01)。初级卵泡、次级卵泡、成熟卵泡、闭锁卵泡数在模型组大鼠于1w、2w、3w、4w时均显著增多,与空白对照组比较有显著性差异(P<0.01)；在中药组大鼠于1w、2w、3w时均明显减少,与模型组比较有显著性差异(P<0.05)。(6)对卵巢功能减退大鼠卵巢组织形态学的影响空白对照组大鼠(n=4)卵巢镜下观察各受检卵巢(1w、2w、3w、4w)可清楚的分为皮质和髓质两部分,皮质部有较多大小不一、染色较深的原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、成熟卵泡和闭锁卵泡、黄体及白体,间质腺少见,血管丰富,细胞与纤维组织构成皮质的基质,未发现间质出血、水肿、变性、坏死、纤维化等病变；髓质含丰富的神经、淋巴管和较多的血管,未见充血、变性坏死等异常改变。模型组大鼠(n=4)卵巢镜下观察各受检卵巢(1w、2w、3w、4w)髓质部分萎缩,皮质增生明显,有纤维化样变,闭锁卵泡显著加。中药组大鼠(n=4)卵巢镜下观察各受检卵巢(1w、2w、3w、4w)髓质基本正常,无明显萎缩,皮质增生较少,各级卵泡、黄体等基本同空白对照组,未见明显变性、纤维化等病变。3、加减归肾丸对环磷酰胺所致卵巢功能减退大鼠卵巢功能的影响(1)对卵巢功能减退大鼠体重的影响大鼠腹腔注射CTX后1周,大鼠体重在模型组及各给药组与空白对照组比较显著下降(P<0.05)。给药4周后,大鼠体重在模型组与空白对照组比较显著下降(P<0.05)；在中药各剂量组与西药对照组与模型组比较显著增加(P<0.01),与空白对照组比较无显著性差异(P>0.05)。(2)大鼠动情周期的改变通过阴道涂片观察所得,各组大鼠造模前动情周期变化规律,周期约4~5d。除空白对照组外,其余各组大鼠腹腔注射CTX后大鼠出现动情周期改变,停止于动情间期；空白对照组仍有规律的动情周期。模型组造模后4周内动情周期紊乱；中药高、中剂量组给药后14~15d出现完整的动情周期；中药低剂量组给药后19-20d左右开始出现动情前期,持续8~10d,至给药4周结束前出现动情期；西药对照组给药后15~17d出现动情周期,周期时间延长。(3)对卵巢功能减退大鼠血清E2、FSH的影响大鼠腹腔注射CTX后1周后,血清E2水平在模型组及各给药组大鼠与空白对照组比较显著下降(P<0.01)。给药4周后,E2在中药各剂量组与西药对照组较给药前显著上升(P<0.05),与模型组比较显著增加(P<0.01)；在模型组大鼠与空白对照组比较仍明显降低(P<0.01)。大鼠腹腔注射CTX后1周后,血清FSH水平在模型组及各给药组大鼠与空白对照组比较显著升高(P<0.01)。给药4周后,FSH在中药各剂量组与西药对照组较给药前显著下降(P<0.05),与模型组比较显著降低(P<0.01),在模型组大鼠与空白对照组比较仍显著增高(P<0.01)。(4)对卵巢功能减退大鼠大鼠血清AMH、INHB的影响大鼠腹腔注射CTX后1周后,AMH、INHB在模型组及各给药组大鼠与空白对照组比较显著下降(P<0.05)。给药4周后,AMH、INHB在模型组大鼠与空白对照组比较显著下降(P<0.01)；在中药各剂量组及西药对照组与模型组比较显著增加(P<0.01),与空白对照组比较无显著性差异(P>0.05)。(5)对卵巢功能减退大鼠大鼠卵巢指数的影响大鼠给药4周后,卵巢指数在模型组大鼠与空白对照组比较明显下降(P<0.01)；在中药各剂量组与西药对照组与模型组比较显著增加(P<0.01),与空白对照组比较无显著性差异(P>0.05)。(6)对卵巢功能减退大鼠卵泡数目的影响给药4周后,原始卵泡计数在模型组大鼠与空白对照组比较明显减少(P<0.01)。原始卵泡计数在中药高、中剂量组与模型组比较显著增加(P<0.01及P<0.05)；在中药高剂量组与空白对照组比较无统计学差异(P>O.05)。初级卵泡计数、生长卵泡计数、成熟卵泡计数在模型组与空白对照组比较有统计学差异(P<0.05)；在中药各剂量组与模型组比较显著减少(P<0.05),与空白对照组比较无统计学差异(P>0.05)。(7)对大鼠卵巢结构形态学的影响从卵巢组织病理切片镜下观察可知,空白对照组卵巢皮质结构正常,可见各级卵泡及黄体分布,形态正常,成熟卵泡体积较大,卵泡液较多。模型组卵巢有萎缩,生长卵泡减少,闭锁卵泡较多。中药高、中剂量组生长卵泡较模型组增多,出现较大直径的卵泡,闭锁卵泡减少。中药低剂量组生长卵泡仍较少,原始卵泡可见。西药对照组初级卵泡、生长卵泡增多,成熟卵泡可见。(8)对大鼠卵巢组织VEGF、GDF-9表达的影响应用免疫组化SP法对大鼠卵巢进行VEGF蛋白表达,以卵泡颗粒细胞棕黄色或褐色染色为阳性表达,并进行积分光密度测定。VEGF蛋白在模型组大鼠卵巢卵泡颗粒的表达与空白对照组比较显著减弱(P<0.01),在中药各剂量组表达较模型组显著增强(P<0.01),在中药高剂量组较空白对照组阳性表达增强(P<0.01),在中药中剂量组与空白对照组比较无显著性差异(P>0.05)。应用免疫组化SP法对大鼠卵巢进行GDF-9蛋白表达,以初级及更大卵泡卵母细胞膜出现棕黄色或褐色染色为阳性表达,并进行积分光密度测定。GDF-9蛋白在模型组大鼠卵巢卵母细胞膜的表达减弱(P<0.01),在中药各剂量组及西药对照组表达较模型组强(P<0.01),在中药高、中剂量组与空白对照组比较无显著性差异(P>0.05)结论：1、肾虚肝郁型DOR患者生命质量明显下降,具体表现在社会功能、精神健康及总体健康3个维度受到损害,DOR患者心理健康下降程度远大于躯体健康。其发病与社会、心理因素,生活习惯、文化程度等有关。2、CTX单次腹腔注射可致SD大鼠卵泡发育障碍,性激素分泌紊乱,卵巢功能减退。给药后中药组FSH水平降低,E2水平升高,激素水平与空白对照组无显著性差异,说明加减归肾丸可恢复DOR大鼠动情周期,促进DOR大鼠卵泡的发育及排卵功能,改善DOR大鼠血清高促性腺激素低雌激素状态,从而恢复卵巢功能。3、加减归肾丸可通过多种途径提高卵巢储备功能,具体表现在以下几方面：对下丘脑-垂体-卵巢轴的降调节,减少促性腺激素的分泌；提高DOR大鼠AMH水平；上调DOR大鼠颗粒细胞VEGF水平,通过旁分泌的形式刺激卵泡膜内皮细胞增生,促进卵巢血管生成；可上调DOR大鼠GDF-9蛋白的表达,以此促进始基卵泡募集,促进卵泡发育,抑制卵泡闭锁,以达到排卵的目的。
【作者】陈小平；
【导师】陶莉莉；
【作者基本信息】广州中医药大学，中西医结合临床（专业学位），2014，博士
【关键词】卵巢功能减退；肾虚肝郁；加减归肾丸；生命质量；VEGF蛋白；GDF-9蛋白；

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