中药喘可治注射液对COPD大鼠IL-12/STAT4、IL-4/STAT6信号通路影响研究

【摘要】研究目的：建立慢性阻塞性肺疾病大鼠模型,设置正常组、COPD大鼠模型组及喘可治注射液高、中、低剂量组,检测各组大鼠血清、肺泡灌洗液中细胞因子IFN-γ、IL-12、IL-12R、IL-4、IL-4R水平以及肺组织STAT4、STAT6蛋白、STAT4mRNA、STAT6mRNA表达情况,探讨Thl/Th2分化失衡与COPD发病的联系；观察不同剂量喘可治注射液对细胞因子与STAT4/6蛋白、STAT4/6mRNA表达的影响及其相关性,探讨喘可治注射液通过干预IL-12/STAT4、IL-4/STAT6信号通路,调控Th1/Th2分化平衡而防治COPD的作用机制。研究方法：(1)本实验采用香烟烟熏加气管滴注脂多糖复合造模的方法建立慢性阻塞性肺疾病大鼠模型,从大鼠一般状态观察、肺组织肉眼观察、HE染色病理切片观察以及肺泡灌洗液细胞计数三个指标评价慢性阻塞性肺病大鼠模型以及喘可治注射液对慢性阻塞性肺病大鼠病理改变和炎症细胞水平的影响；(2)采用酶联免疫吸附法对血清和肺泡灌洗液中的IFN-γ、IL-12、IL-12R、IL-4、IL-4R水平进行测定,通过比较分析补肾中药喘可治注射液对血清和BALF中各细胞因子的影响,探讨喘可治注射液对慢性阻塞性肺疾病大鼠的治疗作用；(3)用Westernblot蛋白质印迹法检测实验大鼠肺组织STAT4、STAT6蛋白表达,观察喘可治注射液对其表达的影响,从Th1/Th2分化调节角度评价补肾中药喘可治注射液的药效及其防治COPD的作用机制；(4)采用实时荧光定量PCR技术,对实验大鼠肺组织的STAT4mRNA、STAT6mRNA表达水平进行测定,观察喘可治注射液对其表达的影响,拟从调节Th1/Th2免疫失衡角度评价补肾中药喘可治注射液防治COPD的疗效及作用机理。研究结果：(1)成功复制出COPD大鼠模型,通过大鼠一般状态观察、肺组织肉眼观察、HE染色病理改变观察和肺泡灌洗液白细胞总数与分类计数结果分析,该模型病理形态学与人类COPD改变基本一致；其中与人类相似的症状表现如咳嗽、气喘、呼吸急促等,与COPD临床症状要点基本符合,且模型大鼠呼吸浅急,喘息急促,弓背滞伏蜷卧,喜扎堆,行动迟缓,神情倦怠等亦符合中医肾虚证见证；喘可治注射液有改善COPD大鼠咳喘、口鼻分泌物等临床症状的作用,大鼠毛色光泽、动作、精神状、饮食摄水、口鼻分泌物等情况均较模型组有明显好转；可显著改善COPD大鼠肺组织病理损害,大鼠两肺体积、表面光滑度及弹性、肺大泡情况较模型大鼠明显好转,病理观察大鼠杯状细胞明显少见、炎症细胞浸润明显减轻、支气管管壁无明显增厚,肺泡相对完整,与模型组相比明显减轻；(2)研究发现COPD模型组的总白细胞计数值最高,喘可治注射液高、中、低剂量组与正常组比较均无显著性差异(P>0.05),说明喘可治注射液对COPD大鼠炎症细胞有明显的抑制效果；在细胞分类计数中,各组均以单核巨噬细胞为主,与正常组比较,模型组单核巨噬细胞百分比显著降低(P<0.01),而淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞百分比均显著增加(P<0.01),与模型组比较,喘可治注射液高、中、低剂量组单核巨噬细胞显著增加(P<0.01或P<0.05),淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞百分比显著降低(P<0.01或P<0.05),且与正常组比较均无显著性差异(P>0.05),提示香烟烟雾结合气管滴注脂多糖造模能诱导大鼠单核巨噬细胞百分比降低、升高淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞百分比,而喘可治注射液能明显地升高COPD大鼠的单核巨噬细胞百分比,降低淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞百分比,对COPD大鼠炎症细胞分泌具有明显的抑制作用；不同剂量喘可治注射液对实验大鼠炎症细胞的影响具有明显的量效关系。高、中剂量喘可治对白细胞分泌的抑制作用,对单核巨噬细胞的促进分泌、对淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的抑制分泌作用均优于低剂量组,而高、中剂量组的作用效果相当。(3)发现模型组大鼠中IL-4、IL-4R浓度极显著降低(P<0.01),IFN-γ、IL-12、IL-12R水平显著升高(P<0.01或P<0.05),IFN-γ/IL-4比值亦明显升高(P<0.01),提示香烟烟雾加气管滴注脂多糖造模能诱导COPD大鼠出现Thl细胞优势分化的Thl/Th2失衡；与模型组相比,喘可治注射液各剂量组均可以显著降低COPD大鼠血清和肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-12、IL-12R水平(P<0.01),升高IL-4、IL-4R水平(P<0.01或P<0.05),降低IFN-γ/IL-4比值(P<0.01),说明喘可治注射液是通过下调IFN-Y、IL-12、IL-12R水平,上调IL-4、IL-4R水平,降低IFN-γ/IL-4比值而抑制Th1细胞极化；不同剂量喘可治对COPD大鼠肺泡灌洗液中细胞因子的表达影响具有一定的量效关系：抑制IL-12R表达高、中剂量组优于低剂量组,且两组作用效果相当；促进IL-4表达高剂量组明显优于中、低剂量组；而降低IFN-γ/IL-4比值的作用,高剂量组明显优于低剂量组。(4)发现STAT4和STAT6蛋白在正常组、COPD模型组和各给药组大鼠的肺组织中表达有明显差异(P<0.01或P<0.05),COPD模型组大鼠肺组织中STAT4蛋白的表达较正常组有显著性升高(P<0.01),STAT6蛋白的表达较正常组有显著下降(P<0.01),提示香烟烟雾加气管滴注脂多糖造模能诱导COPD大鼠出现Thl细胞优势分化的Th1/Th2失衡；与模型组比较,喘可治高、中、低剂量组COPD大鼠肺组织中STAT4蛋白条带印记颜色均变浅,表达强度极显著减弱(P<0.01),STAT6条带印记颜色均加深,表达强度显著增强(P<0.01或P<0.05),提示喘可治注射液可显著抑制COPD大鼠肺组织中STAT4蛋白表达,促STAT6蛋白的表达,STAT6条带印迹颜色相近,表达强度比较无显著性差异(P>0.05),提示喘可治注射液对COPD大鼠肺组织STAT6蛋白表达的影响无明显量效关系；STAT4蛋白条带CKZ-H与CKZ-L比较有显著性差异(P<0.01),提示高剂量喘可治抑制STAT4蛋白表达的效果优于低剂量组；相关性分析提示,STAT4、STAT6蛋白表达呈负相关性,喘可治注射液作用后STAT6蛋白表达量越多,STAT4相应的表达量越少。(5)与正常组比较,模型组大鼠肺组织STAT4mRNA相对表达水平极显著升高(P<0.01),STAT6mRNA相对表达水平显著性降低(P<0.01),提示香烟烟熏加气管滴注LPS引起实验大鼠肺组织STAT4mRNA表达亢进,STAT6mRNA表达抑制；与模型组组比较,各药物治疗组大鼠肺组织STAT4mRNA的表达均显著降低(P<0.01),STAT6mRNA相对表达量极显著增多(P<0.01),提示喘可治注射液可抑制STAT4mRNA的表达,促进STAT6mRNA表达；随着喘可治注射液给药剂量的增加肺组织STAT4、STAT6mRNA的表达越接近正常组,STAT4mRNA表达CKZ-H与CKZ-L有显著性差异(P<0.05),STAT6mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05),提示高剂量喘可治注射液降低COPD大鼠肺组织STAT4mRNA表达的作用优于低剂量组,而各剂量组对STAT6mRNA的表达无明显量效关系。研究结论：1)CODP模型大鼠存在Thl/Th2分化失衡且呈现Th1细胞优势分化状态,其血清和肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-12、IL-12R表达亢进,而IL-4、IL-4R水平低下,IFN-γ/IL-4比值升高；2)喘可治注射液对COPD大鼠炎症细胞分泌具有明显的抑制作用,能显著改善大鼠肺组织病理损害,能显著地降低COPD大鼠的淋巴细胞百分比、中性粒细胞百分比、嗜酸性粒细胞百分比,提高单核细胞百分比：3)喘可治注射液可通过调节细胞因子表达抑制Thl细胞极化、促进Th2细胞分化,可以显著降低COPD大鼠血清和肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-12、IL-12R水平,升高IL-4、IL-4R水平,降低IFN-γ/IL-4比值,从而调节COPD大鼠Thl/Th2分化失衡、减轻炎症反应：4)喘可治注射液防治COPD的可能机制之一是调控STAT4/6信号通路抑制Th1细胞增殖、促Th2细胞表达、调节大鼠Th1/Th2失衡,其可以显著降低COPD大鼠肺组织中STAT4蛋白、STAT4mRNA水平,显著升高STAT6蛋白、STAT6mRNA水平；5)不同剂量喘可治注射液对实验大鼠炎症细胞、肺泡灌洗液中细胞因子及组织STAT4蛋白、STAT4mRNA表达的影响具有一定的量效关系：高、中剂量喘可治对炎症细胞的影响作用效果相当,均优于低剂量组；高、中剂量组抑制IL-12R表达优于低剂量组,促进IL-4表达高剂量组优于中、低剂量组,而降低IFN-γ/IL-4比值的作用,高剂量组明显优于低剂量组；高剂量喘可治抑制STAT4蛋白、STAT4mRNA表达的效果优于低剂量组。结论:COPD模型大鼠存在Thl细胞优势分化的Thl/Th2分化失衡；喘可治注射液可抑制IFN-γ、IL-12、IL-12R及STAT4蛋白、STAT4mRNA的过度表达,调节由IFN-γ、IL-12启动的,经IL-12R、STAT4信号转导的Thl细胞分化亢进过程；可促进IL-4、IL-4R及STAT6蛋白、STAT6mRNA表达,调节由IL-4激发的,由IL-4R、STAT6信号转导的Th2细胞分化,从而缓解COPD大鼠Th1/Th2分化失衡状态。推测COPD的发生与Thl/Th2分化失衡密切相关；喘可治注射液抑制炎症细胞分泌、改善COPD肺组织病理损害、防治COPD的可能作用机制与其干扰IL-12/IL-12R/STAT4、IL-4/IL-4R/STAT6信号通路对靶基因的激活,下调STAT4mRNA表达,上调STAT6mRNA表达,进而调节Th1/Th2分化失衡有关。
【作者】黄纯美；
【导师】刘小虹；
【作者基本信息】广州中医药大学，中医内科学，2014，博士
【关键词】COPD；喘可治注射液；Th1/Th2失衡；信号通道；实验研究；

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