益气提升法对脱垂性内痔抗衰老蛋白家族的影响研究

【摘要】人类于痔的最早记录出现在公元前770年,但是直到今天,痔的本质是什么?在学界内部仍处在无休无止的争论中,我们不得不面对的是：我们对于痔的主要发病机理尚未完全确定。随着科学的与时俱进,不断有学者致力于痔的讨论和研究,通过努力工作、有效的研究和探讨,直到上个世纪70年代,我们方才提出具有划时代意义的“肛垫下移学说”,并在之后的研究中进一步丰富和发展了这一学说。尽管痔“肛垫理论”是目前多数学者所承认的,但依据目前的研究基础,仍无法解释痔的确切本质,导致病变的肛垫是什么?到目前为止的研究理论尚不能对这一问题作出有针对性的回答。因此,目前关于“肛垫下移学说”的研究只是处于最初的理论探讨阶段,痔组织病变的分子生物学研究更是缺乏有力的临床及实验的证明,对肛垫特征的认识还不能真正地指导临床应用。本论文在益气提升法治疗脱垂性内痔取得良好临床疗效的基础上,应用分子生物学研究的手段,测定不同脱垂程度的内痔标本中的Fibulin家族(Fibulin-3、Fibulin-5)mRNA及蛋白的表达量,通过研究不同程度脱垂性内痔组织中Fibulin家族mRNA及蛋白的表达水平的差异,探讨Fibulin蛋白家族与脱垂性内痔发生、发展的内在关联性。同时,本研究应用临床分析研究和分子生物学研究的手段,在补中益气颗粒干预后,分析研究内痔组织中Fibulin蛋白家族mRNA表达的动态表化,研究益气提升法治疗脱垂眭内痔的作用机理,揭示益气提升法通过延缓Fibulin蛋白家族衰老、治疗脱垂性痔病的作用通路。本实验的设计出发点在于为肛垫下移学说寻求分子生物学的证据；为中医药理论诊断、治疗脱垂性内痔提供现代科学依据。目的：本研究旨在通过以下两个途径：(1)途径一、探讨不同程度脱垂性内痔组织中抗衰老蛋白Fibulin家族(注：Fibulin-3及Fibulin-5)mRNA及蛋白的表达水平；(2)途径二、在益气提升法干预后,研究病例的Ⅱ度内痔组织中Fibulin蛋白家族mRNA表达的变化。本研究期望达到两研究个目的：(1)目的一、探讨Fibulin蛋白家族与脱垂性内痔发生、发展是否存在关联性?如果存在关联性,那么存在怎样的关联性?(2)目的二、深入研究益气提升法治疗脱垂性内痔的作用机理：益气提升法是否通过延缓Fibulin蛋白家族衰老、起到治疗脱垂性内痔的作用?从而为进一步阐明脱垂性内痔的发病机制寻找突破口,同时为治疗和预防该病明确机制。方法：实验(一)1.分组方案研究对象来源于2010年1月～2013年12月广州中医药大学第一附属医院肛肠科住院部及门诊患者,共计64例。其中Ⅱ度内痔患者21例、Ⅲ度内痔患者22例、Ⅳ度内痔患者21例。与此同时,选择低位单纯性肛瘘病的22例患者,作为对照组。2.标本的采集与提取在Ⅱ度、Ⅲ度、Ⅳ度内痔患者接受“内痔切除术”后,留取切除的内痔组织作为标本；低位单纯性肛瘘患者在行“低位肛瘘切除术”过程中,提取患者未发生病变的“肛垫”的正常组织作为对比标本。上述实验组及对照组标本取材长度均为0.5cm,离体30min内无菌条件下立即至于-80℃冰箱或液氮中保存备用。3.实验方法①总RNA提取和逆转录②实时定量PCR检测Fibulin-3mRNA水平③免疫蛋白印迹法检测Fibulin-3蛋白表达4统计学处理用SPSS13.0软件处理数据。数据以均数±标准差(X±S)表示。各组Fibulin-3表达结果之间进行独立样本t检验及单因素方差分析。P<O.05为差异有统计学意义；P<O.01为差异有显著统计学意义。实验(二)1.分组方案研究对象来源于2010年1月～2013年12月广州中医药大学第一附属医院肛肠科住院部及门诊患者,共计62例。其中Ⅱ度内痔患者纳入20例、Ⅲ度内痔患者纳入20例、Ⅳ度内痔患者纳入22例。同时期,选择低位单纯性肛瘘病的17例患者,作为对照组。2.标本的采集与提取在Ⅱ度、Ⅲ度、Ⅳ度内痔患者接受“内痔切除术”后,留取切除的内痔组织作为标本；低位单纯性肛瘘患者在行“低位肛瘘切除术”过程中,提取患者未发生病变的“肛垫”的正常组织作为对比标本。上述实验组及对照组标本取材长度均为0.5cm,离体30min内无菌条件下立即至于-80℃冰箱或液氮中保存备用。3.实验方法①总RNA提取和逆转录②实时定量PCR检测Fibulin-5mRNA水平③免疫蛋白印迹法检测Fibulin-5蛋白表达4.统计学处理用SPSS13.0软件处理数据。数据以均数±标准差(X±S)表示。各组Fibulin-5表达结果之间进行独立样本t检验及单因素方差分析。P<O.05为差异有统计学意义；P<O.01为差异有显著统计学意义。实验(三)1.分组方案研究对象来源于2010年-2013年广州中医药大学第一附属医院肛肠科住院部及门诊患者,共计49例。全部患者均诊断为Ⅱ度内痔。将患者随机分为四组(治疗组3组；对照组1组)。其中,Ⅱ度内痔治疗1组(简称“A组”)：n=11例；Ⅱ度内痔治疗2组(简称“B组”),n=12例；Ⅱ度内痔治疗3组(简称“C组”),n=9例。对照组1组(简称“D”)：n=7例。2.标本的采集与提取各组干预方法如下。A组：服用补中益气颗粒；B组：口服草木犀流浸液片；C组：服用补中益气颗粒+草木犀流浸液片。D组仅作空白对照。以2W为一疗程,全部病例治疗于2个疗程后结束。疗程停止后第2天,各组患者进行临床观察及数据分析。安排患者在局部浸润麻醉下行“内痔切除术”,并对各病例术后留取的内痔标本进行Fibulin-3mRNA、Fibulin-5mRNA表达的测试。3.实验方法①检测安全性指标：一般体检项目,血、尿、大便常规,肝、肾功能检查,心电事件记录检查；②检测疗效性指标1：临床表现的变化,计算治疗组(“A+B+C”组)和“D组”的有效率；③检测疗效性指标2：检测各组样本组织中Fibulin-3mRNA表达水平；检测各组样本组织中Fibulin-5mRNA表达水平。4.统计学处理：计数资料用X2检验,等级资料及百分率的比较用Ridit分析,计量资料用方差分析、t检验。应用SPSS10.0软件进行分析。结果：结果(一)1、将各组样本对象Fibulin-3mRNA最终的表达水平进行对比,包含Ⅱ度内痔、Ⅲ度内痔及Ⅳ度内痔在内的“内痔组”和“对照组”手术标本中都可以检测到Fibulin-3mRNA的表达(Fibulin-3mRNA表达≠0)。“内痔组”标本中Fibulin-3mRNA表达量为0.68±0.37,“对照组”标本Fibulin-3mRNA表达量为0.954-0.43,对比发现：“内痔组”标本中Fibulin-3mRNA表达量处于较低水平,’经独立样本的t检验,两组差异具有统计学意义。2、在“内痔组”中：Ⅱ度内痔组的Fibulin-3mRNA的表达量为0.69±0.17、Ⅲ度内痔组的Fibulin-3mRNA的表达量为0.56±0.15、Ⅳ度内痔组的Fibulin-3mRNA的表达量为0.42±0.22。各组比较,随临床脱垂程度增加Fibulin-3mRNA表达量有逐渐降低的趋势,而且各组间两两比较的结果显示,每两组间(Ⅱ度内痔组与Ⅲ度内痔组之间；Ⅲ度内痔组与Ⅳ度内痔组之间；Ⅱ度内痔组与Ⅳ度内痔组之间)对比,各组差异均具有统计学意义。3、将各组中样本对象Fibulin-3的蛋白表达水平进行对比,“内痔组”和“对照组”手术标本中都出现了Fibulin-3蛋白的表达。“对照组”标本中Fibulin-3蛋白的表达量为1.15±0.53；“内痔组”切除标本Fibulin-3蛋白表达量为0.77±0.47。“内痔组”的Fibulin-3的蛋白表达处于较低的水平,经独立样本的t检验,两组差异具有统计学意义。4、不同“内痔组”的Fibulin-3蛋白的表达量是不同的：①Ⅱ度内痔组中Fibulin-3的蛋白表达量为0.79±0.35；②Ⅲ度内痔组中Fibulin-3的蛋白表达量为O.57±O.37；③Ⅳ度内痔组中Fibulin-3RNA的蛋白表达量为0.36±0.29。各组间两两比较的结果提示,每两组间(Ⅱ度内痔组与Ⅲ内痔组；Ⅲ度内痔组与Ⅳ度内痔组；Ⅱ度内痔组与Ⅳ度内痔组)对比,各组差异均具有统计学的意义。结果(二)1、将各研究组中样本对象Fibulin-5mRNA的表达水平进行对比：发现包括Ⅱ度内痔、Ⅲ度内痔及Ⅳ度内痔在内的“内痔组”和“对照组”手术标本中均可以检测到Fibulin-5mRNA的表达。其中,“内痔组”标本中Fibulin-5mRNA表达量为0.32±0.22,“对照组”标本Fibulin-5mRNA表达量为0.83±O.31,“内痔组”标本中Fibulin-5mRNA表达量较低,经独立样本的t检验,两组差异具有统计学意义。2、对于“内痔组”来讲,不同组别的Fibulin-5mRNA的表达量也是区别明显的：①Ⅱ度内痔组中Fibulin-5mRNA的表达量为O.52±0.27；②Ⅲ度内痔组中Fibulin-5mRNA的表达量为0.37±0.18；③Ⅳ度内痔组中Fibulin-5mRNA的表达量为O.23±0.20。各组间两两比较的结果同样显示,每两组间(Ⅱ度内痔组与Ⅲ度内痔组；Ⅲ度内痔组与Ⅳ度内痔组；Ⅱ度内痔组与Ⅳ度内痔组)对比,各组差异均具有统计学意义。3、将各组中样本对象Fibulin-5的蛋白表达进行对比,结果发现：“内痔组”和“对照组”手术标本中都出现了Fibulin-5蛋白的表达。其中,“对照组”标本中Fibulin-5蛋白的表达水平为1.10±0.47；“内痔组”标本Fibulin-5蛋白表达量为0.58±0.45,“内痔组”的Fibulin-5蛋白表现为低表达水平,经独立样本的t检验,两组差异具有统计学意义。4、在不同的“内痔组”,Fibulin-5蛋白的表达量也不同：①Ⅱ度内痔组中Fibulin-5的蛋白表达量为0.79±0.33；②Ⅲ度内痔组中Fibulin-5的蛋白表达量为O.61±O.21；③Ⅳ度内痔组中Fibulin-5的蛋白表达量为0.44±0.26。每两组间对比,各组间差异均具有统计学意义。结果(三)1、应用了不同药物干预后的各“治疗组”与空白“对照组”临床疗效比较,“A组”(补中益气颗粒)有效率为81.8%,“B组”(草木溪浸液片)有效率为75.0%,“C组”(补中益气颗粒+草木犀流浸液片)有效率为100.0%。将“A组”、“B组”、“C组”作为观察对象,计算Ⅱ度内痔治疗组(总)有效率为84.4%,高于“D组”的有效率23.33%,两组治疗有效率对比,差异具有显著统计学意义(P<0.01)。2、各Ⅱ度内痔治疗组和对照组标本组织中均可以获得到Fibulin-3mRNA的稳定的表达：“A组”标本中Fibulin-3mRNA表达量为0.74±0.18；“B组”标本中Fibulin-3mRNA表达量为0.68±0.24；“C组”标本中Fibulin-3mRNA表达量为0.82±0.14,“D组”内痔标本中Fibulin-3mRNA表达量为0.53±0.17。另外,“D组”分别与“A组”、“B组”、“C组”两两进行比较,“D”组组织中Fibulin-3mRNA表达呈现低表达状态：“D组”中样本的Fibulin-3mRNA表达量与“A组”、“B组”、“C组”标本中Fibulin-3mRNA表达量均具有差异(经独立样本t检验),其差异具有统计学意义(P<0.05)。3、各Ⅱ度内痔治疗组和对照组标本中均能够检测到Fibulin-5mRNA,其中：“A组”标本中Fibulin-5mRNA表达量为O.50±0.14,“B组”标本中Fibulin-5mRNA表达量为O.47±0.15；“C组”标本中Fibulin-5mRNA表达量为O.65±O.19,“D组”标本中Fibulin-5mRNA表达量为0.44±O.11。此外,“D组”分别与“A组”、“B组”、“C组”两两进行比较,结果显示“D组”中Fibulin-5mRNA表达呈现“低表达状态”：“D组”中样本的Fibulin-5mRNA表达量与各个治疗组标本中Fibulin-5mRNA表达量均存在差异性(经独立样本t检验),其差异具有统计学意义(P<0.05)。结论：结论(一一)Fibulin-3的缺失可能会导致MMPs活性增高,而MMPs的活性增高是加快弹性纤维崩解、局部组织弹性力下降,进而促使脱垂性内痔的发生的重要原因之一。结论(二)Fibulin-5的缺失可能会导致弹性蛋白合成障碍,而弹性纤维合成障碍是最终导致弹性纤维病变、盆底起支撑作用的结构松弛、局部组织弹性力下降,进而促使脱垂性内痔的发生的重要原因之一。结论(三)包括益气提升法在内的不同干预手段可能是通过提高Fibulin-3mRNA(及Fibulin-5mRNA)的表达最终发挥治疗作用的。结论(四)提高Fibulin-3mRNA(及Fibulin-5mRNA)的表达可能是治疗有脱垂表现的Ⅱ度内痔的一种手段。结论(五)不同的治疗方案对提高Fibulin-3mRNA(及Fibulin-5mRNA)的表达存在差异性。结论(六)以脱垂症状为主要表现的Ⅱ度内痔有一定的自愈性。
【作者】孙锋；
【导师】崔学教；
【作者基本信息】广州中医药大学，中医外科学（专业学位），2014，博士
【关键词】益气提升法；内痔；弹性纤维；Fibulin-3；Fibulin-5；

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