次乌头碱调控高迁移率族蛋白B1抗内皮细胞损伤

【摘要】研究目的：高迁移率族蛋白B1(highmobilitygroupbox1,HMGB1)是一种核内非组蛋白结构蛋白,它的合成、分泌和释放与细胞的损伤密切相关。在细胞损伤的中晚期HMGB1蛋白乙酰化,并从细胞核内向细胞浆中迁移,随后在溶酶体协助下释放出胞。胞浆中堆积的HMGB1蛋白能激活细胞的自噬,释放到胞外的HMGB1能通过RAGE、TLR4等细胞膜受体激活细胞MAPKs通路,并能激活细胞NF-κB通路促进细胞内TNF-α,VCAM-1,ICAM-1,ILs等炎症因子表达,同时诱导更多HMGB1蛋白的分泌和释放,从而形成正反馈回路使细胞损伤级联性放大,因此细胞外及胞浆内的HMGB1被认为是损伤相关模式分子,是细胞损伤的关键因子。同时,由于具有出现时间晚、分泌时间长的特点,HMGB1被认为可能成为急重症疾病治疗并扩大治疗时间窗的一个有效的靶点,其研究具有重要临床意义。附子是一种具有回阳救逆功效的中药,临床中常将其运用于休克、缺血缺氧性治疗。临床观察和动物实验均证实以附子为主药的参附注射液、四逆汤等对多种休克造成的内皮细胞损伤具有保护作用,但附子的抗内皮细胞损伤作用及相关机制目前尚未见报道。因此,本研究通过建立内皮细胞损伤模型,探索附子抗内皮细胞损伤的物质基础,并探讨其通过调控细胞HMGB1蛋白对抗内皮细胞损伤的具体机制。研究方法：1.采用噻唑蓝(MTT)、Westernblot法检测过氧化氢、氧化型低密度脂蛋白对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)细胞活性的影响,并用附子多种单体成分,即次乌头碱、乌头碱、新乌头碱及苯甲酰乌头原碱分别处理两种内皮细胞损伤模型,从而筛选出附子保护内皮细胞的活性成分。2.采用Westernblot法检测过氧化氢、氧化型低密度脂蛋白对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)细胞凋亡相关蛋白activatecaspase3表达的影响,用附子保护内皮细胞的活性成分处理两种细胞模型,观察该成分是否能对抗内皮细胞凋亡性损伤。3.运用ELISA、Westernblot检测法观察oxLDL对内皮细胞HMGB1胞外释放与核外迁移水平的影响；用附子活性成分处理细胞模型,观察附子活性成分在内皮细胞内是否能影响oxLDL诱导的HMGB1的迁移与释放。4.进行转录因子基因芯片检测,探索附子活性成分对细胞转录因子转录水平的影响；并从差异表达基因中筛选出与HMGB1蛋白表达、迁移与释放相关的基因,根据附子活性成分对HMGB1的调控作用筛选出附子活性成分保护内皮细胞的可能靶基因。5.运用qRT-PCR检测,观察次乌头碱对可能靶基因转录水平的影响,验证基因芯片结果；用Westernblot检测观察次乌头碱对该基因蛋白表达水平的影响。6.运用相应拮抗剂,拮抗次乌头碱调对预测靶基因的调控,验证次乌头碱是通过调控该基因对抗内皮细胞损伤的。7.运用药物拮抗次乌头碱对HMGB1蛋白的调控,验证次乌头碱是通过调控上述基因表达、影响HMGB1蛋白的迁移和释放途径,对抗内皮细胞损伤的。研究结果：1.过氧化氢和oxLDL能抑制内皮细胞活性,附子多种成分中次乌头碱对内皮细胞的保护作用最明显。2.过氧化氢和oxLDL能诱导内皮细胞凋亡蛋白activatecaspase3蛋白的表达,次乌头碱对损伤内皮细胞activatecaspase3蛋白的表达的抑制作用呈剂量依赖。3.内皮细胞损伤后,细胞HMGB1蛋白的核外迁移与胞外释放水平增加,次乌头碱能抑制损伤后细胞HMGB1的迁移及释放。4.基因芯片结果显示,次乌头碱可能是靶向HDAC3对抗内皮细胞凋亡性损伤的,qRT-PCR及Westernblot结果显示次乌头碱可以促进HDAC3的转录与表达。5.将次乌头碱作用与HDAC3基因沉默的内皮细胞后,不能抑制内皮细胞HMGB1蛋白的分泌和释放,同时不能抑制oxLDL诱导的内皮细胞凋亡。6.促进HMGB1分泌和释放的药物SB与次乌头碱同时作用与内皮细胞,次乌头碱则不具有对抗内皮细胞凋亡性损伤的作用。研究结论：1.次乌头碱是附子抗内皮细胞损伤的活性成分,能对抗内皮细胞的凋亡。2.次乌头碱通过促进HDAC3的表达抑制HMGB1的迁移与释放。3.次乌头碱通过抑制细胞HMGB1蛋白的分泌和释放,抑制内皮细胞凋亡。
【作者】白晔；
【导师】陈东风；
【作者基本信息】广州中医药大学，中西医结合基础，2014，博士
【关键词】附子；次乌头碱；内皮细胞；细胞损伤；HMGB1；HDAC3；

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