鱼腥草抑制鸡毒支原体感染有效部位的筛选及其免疫学机理研究
【摘要】支原体是已知的能白行增殖的生物中最小的一类微生物,宿主范围广泛,包括人、动物、昆虫和植物,其引起的呼吸道疾病,严重影响人类和动物健康。这类疾病的显著标志是引起免疫抑制,造成机体持续的支原体感染和呼吸道慢性炎症过程。鱼腥草,味辛,性微寒,归肺经,具有清热解毒、消痈排脓等功能,临床主要用于治疗痰热喘咳等肺部疾病。中医学认为疾病的发生、发展和转归取决于正邪的消长,与机体的免疫功能密切相关,因此中医提出了“扶正祛邪”的主要治病原则,按现代免疫学理论可称为“提高机体免疫功能”,体现了现代免疫学的朴素原理。目的：以鸡毒支原体作为研究对象,运用现代中药提取分离技术,提取鱼腥草的总多糖、总黄酮、挥发油三个部位,通过体内外试验研究筛选出鱼腥草抑制支原体感染的有效部位,并采用药理学方法、分子生物学方法、免疫学方法等探讨其有效部位抑制MG感染的免疫学治疗机理。充分阐明清热解毒类中药在抗感染治疗方面,既清除病原体又具有免疫调节作用,既祛邪又扶正的药理学作用,并为研制安全有效、质量可控的鱼腥草有效部位新制剂提供基础工作。方法：1.采用水提醇沉法提取总多糖；通过比较水提取、醇提取、索氏回流提取、微波辅助提取等提取方法确定总黄酮最佳提取方法,并采用正交实验优化总黄酮提取工艺；采用水蒸汽蒸馏法提取鱼腥草挥发油。并测定主要成分含量。2.通过荧光染料筛选、菌液浓度优化、染色条件和仪器方法等的优化建立流式细胞术快速药敏实验方法。用建立的方法筛选鱼腥草体外抑制鸡毒支原体的有效部位,并采用传统药敏实验法对其进行验证。3.SPF鸡胚尿囊腔接种梯度浓度的支原体菌液,人工制造发病模型,通过鸡胚发育状况、肺脏组织切片、病原学检查、血清学检查等手段验证模型的有效性。4.通过动物感染模型筛选鱼腥草抑制支原体感染鸡胚的有效部位及其发挥作用的免疫学机理。鱼腥草系列提取物给与鸡胚感染模型后,采用组织切片观察鱼腥草提取物对鸡胚肺组织的修复；采用PCR方法检测鱼腥草提取物对鸡胚肺脏组织中病原的抑制作用；采用实时荧光定量PCR法检测鱼腥草对IL-4、IL-6、IL-12、IFN-y等细胞因子的表达情况的影响；采用流式细胞术方法检测CD4+/CD8+T细胞表面抗原的表达情况,筛选出可有效抑制鸡毒支原体的有效部位并探索鱼腥草抑制鸡毒支原体感染的作用机理。结果：1.比较实验结果表明,水提法为鱼腥草总黄酮有效部位最佳提取方法,正交试验确定水提法最佳工艺条件为浸泡时间1h,提料液比1：30,提取时间90min,提取次数3次。总多糖得率为2.24%,总黄酮含量为2.54%。GC-MS鉴定水蒸气蒸馏法得到鱼腥草主要的21种挥发油,其中3个烯类化合物(4.85%),4个醛类化合物(34.04%),2个酯类物质(6.96%),2个酮类(14.73%),8个醇类(29.41%),2个酸类化合物(9.92%)。2.本研究建立了SYBR/PI,CFDA/PI两种双染色方法应用于抗鸡毒支原体中药流式细胞术药敏实验。SYBR/PI双染色法最佳工作条件为：SYBR工作稀释度1：500000,PI工作浓度1μg.mL-1,工作缓冲液PH7.4PBS,孵育时间10min。CFDA/PI双染色法最佳工作条件为：CFDA工作浓度1μM,PI工作浓度1μg.mL-1,工作缓冲液PH7.4PBS,孵育时间10min。并建立了绝对计数方法。用建立的方法筛选得到挥发油为鱼腥草体外抑制鸡毒支原体生长的有效部位。与传统纸片法药敏试验结果一致。3.建立了鸡毒支原体感染鸡胚模型。从鸡胚发育状况、组织切片、病原学检验、血清学检验的结果显示：中剂量感染组鸡胚活动减弱,死亡率低(17%),病理切片结果表明肺组织支气管充血,轻微水肿,PCR检测肺组织鸡毒支原体感染情况,该组样品均为阳性。确定中剂量为鸡毒支原体感染鸡胚模型的最佳攻毒剂量,即为尿囊腔接种100μL/只,菌液浊度为2×108ccu·mL1。该病理模型实验条件稳定,对病原的反应一致,重复性好。4.鱼腥草提取物体内抑制鸡胚感染模型的有效性及免疫学机理研究。(1)组织切片结果表明,MG感染机体后,主要侵染肺组织,造成肺脏组织结构遭到破坏,肺泡间隔增厚,肺泡腔缩小,肺泡壁扩张充血,肺泡腔水肿,炎性细胞浸润等病理变化。经鱼腥草提取物治疗后,各组肺脏组织结构均有不同程度的改善,组织结构恢复正常,仅有少量炎性细胞侵润。(2)PCR方法检测鱼腥草提取物对鸡胚肺脏组织中病原的抑制作用,结果表明,挥发油组和总黄酮组在体内对MG有一定的抑制作用,抑制率为66.7%。(3)荧光定量PCR技术检测IL-4、IL-6、IL-12、IFN-y等细胞因子的表达情况。与感染对照组比较,挥发油组中,脾脏IL-12mRNA的表达显著提高(P<0.05),脾脏FN-γmRNA的表达提高,IL-4mRNA的表达降低；总多糖组中,脾脏IFN-ymRNA的表达显著提高(P<0.05),IL-12mRNA的表达升高；总黄酮组中,高表达的IL-4、IL-6mRNA的表达降低,IFN-y和IL-12mRNA的表达无影响；三种提取物均降低脾脏中IL-4mRNA的表达,但与感染对照组差异不显著(P>0.05)；鱼腥草提取物降低脾脏中IL-6mRNA的表达,与感染对照组差异不显著(P>0.05)。与感染组相比,各有效部位对IL-4、IL-6mRNA有降低作用；对IFN-γ、IL-12mRNA具有升高作用。(4)流式细胞术技术检测脾T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+T细胞百分率变化。攻毒组CD4+和CD8+T淋巴细胞指标明显下降,与正常对照组比较,统计学差异显著(P<0.01),挥发油组与感染对照组相比较,差异显著(P<0.05),其他各组CD4+和CD8+T淋巴细胞指标与感染组比较均有上升,但无统计学差异。结论：(1)本研究提取了鱼腥草总多糖、总黄酮、挥发油三个有效部位。(2)建立了流式细胞术快速药敏试验方法,筛选得到鱼腥草体外抑制鸡毒支原体感染的有效部位为挥发油。(3)建立了鸡毒支原体感染的鸡胚模型。(4)本研究体内试验结果表明：①挥发油可能为体内抑制MG感染的有效部位,其可能的作用途径为促进机体细胞免疫,主要增强Th1类细胞因子IFN-γ、L-12mRNA的表达,抑制Th2类细胞因子IL-4mRNA的表达,从而重建Thl/Th2反应的平衡,实现对免疫功能的调节,产生抑制MG感染的药效。②总黄酮和总多糖也具有一定的免疫调节作用。总黄酮可能是通过提高CD4+T细胞比例,促进机体细胞免疫,降低高表达的IL-4、IL-6mRNA的表达,偏向Th2反应发挥免疫调节作用；总多糖通过显著提高脾脏中IFN-ymRNA的表达,升高IL-12mRNA的表达,主要偏向Th1反应发挥免疫调节作用。
【作者】孙俊颖；
【导师】吴清和；
【作者基本信息】广州中医药大学，中药学，2014，博士
【关键词】鱼腥草；鸡毒支原体；有效部位；流式细胞术；免疫机理；
【参考文献】
[1]秦斐.计算机局域网络物资管理信息系统的设计与实现[J].冶金自动化,1992,01:31-34+63-64.
[2]单从玺.兰州石化公司安全文化建设的研究[D].兰州大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[3]赵宏展,徐向东.承包商管理——职业安全健康管理中的重要环节[J].中国安全科学学报.2005(06)
[4]陈寒石,房倚天,黄戒介,徐奕丰,杨金权,张建民,王洋.加压灰熔聚流化床粉煤气化技术的研究与开发[J].煤炭转化.2000(01)
[5]安静,王振宇,刘冉,于震,李婷婷,尹红力.黑木耳多糖对大豆蛋白乳化性的影响[J].食品工业科技.
[6]万宣辰.功能视角下中国农村金融体系改革研究[D].吉林大学,金融学,2013,硕士.
[7]汤溢飞.基于癌症异质性寻找前列腺癌相关新型miRNA调控的生物通路[D].苏州大学,系统生物学,2013,硕士.
[8]曹秀玲.QJ9000标准简介[J].质量与可靠性.1999(03)
[9]薛薇.LH汽车销售企业客户满意度研究[D].西北大学,工商管理（专业学位）,2012,硕士.
[10]叶伟.无反应肺炎的临床分析[D].大连医科大学,内科学,2012,硕士.
[11]张鸿亮.3.1～3.4GHz 120W功率放大模块研制[D].西安电子科技大学,电子与通信工程,2010,硕士.
[12]靳海霞.黄土丘陵区采煤沉陷损毁耕地复垦费用研究及实证[D].中国地质大学（北京）,资源管理工程,2013,硕士.
[13]任佩剑.长青学院校园网安全解决方案[D].兰州大学,计算机技术（专业学位）,2013,硕士.
[14]张倩.薄氏腹针治疗膝关节骨性关节炎临床疗效观察[D].北京中医药大学,针灸推拿学,2013,硕士.
[15]李盼.乙肝可复制型DNA疫苗低电压电穿孔递送与免疫活性研究[D].新疆大学,生物学,2013,硕士.
[16]王玉帅.WTO框架下中国农业补贴法律和政策研究[D].对外经济贸易大学,国际法学,2014,博士.
[17]刘肖肖,许新望,王丽军,成有为,李希.分离混合二甲苯的对二甲苯-间二甲苯混合生产工艺的模拟[J].石油化工,2015,02:168-174.
[18]陆玉军.P公司质量管理体系的实施研究[D].苏州大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[19]孙天兵.P3HT:PCBM聚合物太阳能电池特性研究[D].哈尔滨工业大学,2011.
[20]李晓笑.中国5种冷杉属植物生态濒危机制研究[D].北京林业大学,自然保护区学,2013,硕士.
[21]高滢.NERMS中个性化资源推荐的设计与实现[D].吉林大学,2004.
[22]杨晓燕.紫杉醇—珠蛋白纳米粒的制备及其靶向CD163高表达巨噬细胞的研究[D].南京大学,制药工程（专业学位）,2013,硕士.
[23]郑淑丽.增权理论视角下面向“三失”青少年的社会工作个案帮扶途径与方法研究[D].首都师范大学,课程与教学论,2014,硕士.
[24]冯海生,王黎钦,郑德志,赵小力,戴光昊.柔性齿轮-柔性转子-滑动轴承系统动特性分析[J].哈尔滨工程大学学报,2015,03:.
[25]大卫·塔波特.海水淡化——无奈的选择[J].科技创业,2014,Z2:90-94.
[26]陈晓楠.河南汉代墓室顶部图像初步研究[D].江苏师范大学,考古学,2013,硕士.
[27]韩玥,杨本专,程建平.铁路货车综合检测系统[J].中国铁路.2002(09)
[28]崔坤鹏.基于快速原型技术的下颌骨修复及生物力学分析[D].东北大学,机械制造及其自动化,2010,硕士.
[29]李亚群.汉语网络流行语中的日源动漫借词研究[D].湖北师范学院,汉语言文字学,2013,硕士.
[30]李微洁.儿童用品包装中的情趣化设计研究及实践[D].湖南师范大学,设计艺术学,2014,硕士.
[31]左鹏.金融发展对中国出口贸易结构的影响研究[D].北方工业大学,数量经济学,2014,硕士.
[32]石美君.预约合同的认定研究[D].厦门大学,民商法学,2014,硕士.
[33]王伟伟.舟山海洋战略性新兴产业发展的机理与对策研究[D].浙江大学,国际商务（专业学位）,2013,硕士.
[34]简粤.缺陷晶格中超冷原子气体的超流特性[D].西北师范大学,理论物理,2013,硕士.
[35]李方华.扇形元素在标志设计中的应用研究[D].河北大学,设计艺术学,2014,硕士.
[36]秦道武.海洋水下管线系统动态响应建模与仿真研究[D].宁波大学,轮机工程,2013,硕士.
[37]王利娟.“嘉孺子”：周作人的儿童理念[D].北京大学,中国现当代文学,2013,硕士.
[38]马育红.基于元认知能力培养的高中信息技术课程自主学习模式研究[D].首都师范大学,现代教育技术,2014,硕士.
[39]赵允杉.680例结直肠癌临床分析[D].中国人民解放军医学院,外科学,2013,硕士.
[40]陈园园.宋元明泉州港海外贸易研究述评[D].厦门大学,专门史,2014,硕士.
[41]吴永伟,朱忠平.工业控制计算机在高炉沟下称量计量系统中的应用[J].冶金自动化,1993,05:52-54.
[42]王丽媛.止泻颗粒治疗小儿脾虚泄泻的临床观察[D].黑龙江中医药大学,中医儿科学（专业学位）,2013,硕士.
[43]马思义,刘斌.甘肃电视台总控及硬盘播出系统工艺设计[J].广播与电视技术.2004(08)
[44]周苗苗.《孙行者》的互文性研究[D].黑龙江大学,英语语言文学,2013,硕士.
[45]李娟,唐功友.基于观测器的离散时滞系统的故障诊断[J].控制与决策,2010,08:1220-1224.
[46]范秀艳.光照强度和氮素配比对葡萄试管苗氮素代谢的影响[D].甘肃农业大学,果树学,2003,硕士.
[47]原野.重组人干扰素-β1b临床前长期毒性和免疫原性的评价和研究[D].中国人民解放军军事医学科学院,卫生毒理学,2003,硕士.
[48]阿里木江·苏拉依曼.掺Ⅱ级粉煤灰高性能混凝土长期抵抗硫酸盐侵蚀性能研究[D].新疆农业大学,水工结构工程,2012,硕士.
[49]庞力.邯郸地区泵送混凝土回弹法测强曲线的研究[D].河北工程大学,水工结构,2012,硕士.
[50]钟林钧 徐一宁记者丁秀玉.常州成立石墨烯研究院[N].科技日报,2011-10-31006.
