微粉化板蓝根对鸡冠状病毒（IBV）作用的基础研究
【摘要】实验目的：通过干式研磨粉碎法制备微粉化板蓝根颗粒,在原代鸡胚肾细胞模型上比较不同粒径大小的板蓝根颗粒对鸡传染性支气管炎病毒的抑制作用,探讨微粉化对板蓝根活性成分药效的影响。在体外模型实验的基础上,选择最适粒径的板蓝根微粉作为研究对象,通过在鸡胚模型和雏鸡模型比对微粉化后的板蓝根颗粒和没有经过处理的普通板蓝根水提物对鸡传染性支气管炎病毒复制的影响,进一步阐述微粉化处理能提高板蓝根药效,为传统中药开发提供一个新的策略。实验方法：利用简单的干式研磨法对板蓝根药材进行分步粉碎,利用不同孔径的药筛进行分级筛分,以筛分后各不相同粒径的板蓝根颗粒作为研究对象。采用透射电子显微镜法检对所获得的板蓝根微粉粒径的大小进行确证。在体外实验中,选用胰酶冷消化法制备原代鸡胚肾细胞作为体外实验的细胞模型。首先用MTT法检测不同粒径的板蓝根在原代鸡胚肾细胞上的毒性作用,并根据毒性结果作为后续实验的参考浓度。最后在原代鸡胚肾细胞上利用间接免疫荧光法检测不同粒径的板蓝根颗粒对鸡传染性支气管炎病毒M41型在原代鸡胚肾细胞上复制的影响和利用逆转录PCR法检测不同粒径板蓝根颗粒对病毒基因在原代鸡胚肾细胞上复制表达的影响,通过实验探讨微粉化后的板蓝根有效成分随其粒径的变化而发生药效上的变化。在体内实验中,参考体外实验结果选出最佳粒径的板蓝根微粒作为体内药效的评价对象。在体内实验中的鸡胚模型上通过比对未经处理过的板蓝根与微粉化后板蓝根提取物对感染鸡传染性支气管炎病毒鸡胚上的死亡保护实验,以探讨微粉化后板蓝根提取物其有效成分更优于未经处理的板蓝根。在后续实验中,以感染M41型鸡传染性支气管炎病毒的1日龄雏鸡作为实验对象,用未经处理的板蓝根的提取物和经过微粉化后的板蓝根提取物治疗7天,期间观察各组间雏鸡死亡例数计算药物治疗下雏鸡死亡保护率探讨微粉化后板蓝根颗粒与未处理板蓝根间药效区别。通过记录各组间雏鸡动态体重的变化、病理程度、临床症状以及血清中IFN-γ水平对微粉化板蓝根药效进行综合性的评价。实验结果：经过分步粉碎及粉筛可成功获得粒径为550μm、250μm以及100μm大小的微粉化板蓝根颗粒。根据样品获得重量与投料重量比值,550μm板蓝根和粒径250μm、粒径100μm的板蓝根微粉的获得率分别为12%、20.5%和17.8%。经透射电子显微镜法验证受试样品的粒径大小及其结构的完整性,可见各受试样品呈完整的圆球状,适用于后续体外抗冠状病毒实验。利用胰酶冷消化法可以获得存活率达85-88%的原代鸡胚肾细胞。原代鸡胚肾细胞在复苏后经过贴壁12小时候后呈典型上皮样形状,形态正常、边缘整齐适用于后续体外抗病毒药效试验。在各待测样品对原代鸡胚肾细胞的毒性浓度测定的实验中发现,粒径为550μm、250um以及100μm的板蓝根微粉在最大实验浓度200mg/ml浓度上对原代鸡胚肾细胞的破坏率分别为35.7%、18.75%和22.32%。经过对数据进行处理和分析发现,板蓝根体外毒性作用的大小与粒径的大小呈负相关。但粒径550μm和250um间经组间比较其P值大于0.05,提示其毒性作用相当(P>0.05),无统计学意义。而粒径100μm板蓝根颗粒组间比较其P值小于0.05,提示具有统计学意义。利用间接免疫荧光染色法测定M41型鸡传染性支气管炎病毒在原代鸡胚肾细胞上的感染复数M0I为10-5.54/0.2ml。用moi=5的病毒悬液感染原代鸡胚肾细胞,并将不同粒径大小的板蓝根颗粒加入培养基中观察不同粒径板蓝根微粉在不同浓度下对病毒粒子复制的影响。经初步发现粒径在550um的板蓝根微粉在最大实验浓度100mg/ml浓度下对病毒粒子复制有42.77%的抑制作用,而粒径为250um的板蓝根在100mg/ml浓度下对病毒粒子复制有39.16%抑制率,经组间比对两者间无统计学意义(P<0.05)。但粒径为100μm的板蓝根颗粒在同等浓度下(100mg/ml)对病毒粒子复制的抑制率高达63.25%,经统计分析其具有统计学意义和量效关系。而在观察不同粒径板蓝根微粉在不同浓度下对病毒基因表达实验中发现：粒径在550um的板蓝根在100mg/ml浓度下对病毒基因的抑制率仅为31.66%(<50%),其最小实验浓度25mg/ml浓度对病毒基因无抑制作用。粒径在250um的板蓝根颗粒在100mg/ml浓度下对病毒S基因的抑制作用最强,其抑制率可达65.82%,随着实验浓度的降低,其对病毒基因的抑制率下降至49.41%(50mg/ml)、35.21mg/ml(25mg/ml)。粒径在100μm的板蓝根颗粒在100mg/ml、50mg/ml、25mg/ml浓度下起抑制率分别为67.9%、30.1%、36.6%,说明随着板蓝根粒径的减小其体外对冠状病毒抑制的能力越强。在体内实验中,根据体外实验结果选择最佳粒径为100μm的板蓝根颗粒作为研究对象。比较未经处理过的板蓝根和微粉化后的板蓝根在体内对鸡传染性支气管炎病毒M41型的抑制作用,进一步阐明微粉化对板蓝根药效的影响。在鸡胚模型上观察到未处理的板蓝根治疗组和微粉化板蓝根治疗组均能延迟鸡胚死亡的高峰期(与病毒对照组相比,可推迟2天),但微粉化板蓝根对鸡胚的死亡保护作用明显优于未经处理的板蓝根治疗组。病毒对照组在无任何药物治疗下其鸡胚死亡率高达70%；阳性药物利巴韦林对照组的死亡率仅有10%。在微粉化板蓝根治疗下,感染IBV的雏鸡只发生30%的死亡率,远比普通板蓝根组的死亡率低。(普通板蓝根组为50%,低20%)提示微粉化后的板蓝根对IBV感染的雏鸡具有更强的保护作用,能大大降低雏鸡在感染IBV病毒后的死亡率。对感染IBV各组间的雏鸡做动态体重记录总发现病毒对照组体重增加的曲线最为平缓,位于各组曲线之下,提示病毒感染组雏鸡体重增长缓慢。而阳性药物利巴韦林组与正常对照组相当,S100板蓝根对组虽然在前期体重增长较为平缓,但在药物治疗第7天后其增重迅速,可在第10天达到与正常组持平水平。普通板蓝根组中雏鸡体重增加稍弱于S100板蓝根组,后期体重增加较为平缓。通过此图可推断微粉化后的板蓝根能改善雏鸡感染病毒后体重减轻的病情,与普通板蓝根对照组相比具有更强的疗效。在实验结束后对存活雏鸡进行病理解剖发现经过药物治疗后雏鸡其鼻腔、气管等渗出物明显比病毒对照组少(或者无渗出物)、气囊清晰透亮、肾脏上偶见微小出血点等,其症状明显比病毒对照组轻微。提示在药物治疗下感染IBV病毒雏鸡的病理状况明显减轻,而S100板蓝根对照组作用比普通板蓝根明显。在后续实验中,通过观察未经处理的板蓝根治疗组和微粉化后板蓝根治疗组治疗感染IBV雏鸡对雏鸡临床病症的影响中发现：在给予药物治疗下,阳性药物利巴韦林对照组对感染IBV雏鸡呼吸道症状明显减轻(P<0.05)。与病毒对照组相比,普通板蓝根治疗组和S100微粉化板蓝根药物组对IBV感染雏鸡呼吸道症状均有较好的缓解作用(P<0.05)。但与普通板蓝根药物组相比,微粉化板蓝根治疗组仅在流涕及呼吸困难两个方面的作用优于普通板蓝根治疗组(P<0.05),其他两种临床症状无明显差别(P>0.05)。但有趣的是在检测感染IBV病毒雏鸡血液中IFN-y因子水平时,与病毒对照组相比,药物治疗组中的阳性药物利巴韦林与普通板蓝根治疗组均能降低雏鸡血清中的IFN-r因子水平,分别下降的水平为16.42%、16.52%,(P<0.05)；相反微粉化板蓝根颗粒仅能降低雏鸡体内9.46%IFN-r因子水平(P>0.05)。结果间接提示在对感染IBV鸡传染性支气管炎病毒的雏鸡血清中IFN-r因子的作用上,普通板蓝根治疗的效果更强。因此推断微粉化后的板蓝根或许由于在制备过程中容易造成某些活性成分的流失、也或许由于其粒径太小活性成分容易被胃肠道中酶破坏而降低其治疗结果。微粉化能改变中药的机理?结论：经过初步实验获知,通过干式研磨法对板蓝根药材进行分步细化粉碎步骤,结合过滤筛分可获得粒径550μm、250μm和100pm的板蓝根微粉颗粒。其工艺简洁、成本低、效率高、易于操作。微粉化后的板蓝根在体外实验中其毒性作用均降低,但对病毒的抑制能力随着粒径的减小而增强,以粒径为100μm的板蓝根最为显著。在体内实验中,与未经处理的板蓝根治疗组相比,微粉化的板蓝根在抑制M41型鸡传染性支气管炎作用上具有更强的疗效,表现在：延长鸡胚死亡高峰期、降低鸡胚死亡率、减轻感染雏鸡病理程度、缓解雏鸡临床感染症状等各方面。但对雏鸡血清中IFN-γ的影响作用不如未经处理的板蓝根治疗组,因此推断微粉化或许能改变板蓝根抗病毒的机制,为传统中药的开发提供一个全新的方向和策略。针对于此现象,应在今后进行更深的探索,以阐明其中可能存在的机理。
【作者】林诠彬；
【导师】张奉学；
【作者基本信息】广州中医药大学，中西医结合基础，2014，博士
【关键词】微粉化；板蓝根；鸡传染性支气管炎病毒；药效评价；
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