喘可治对艾滋病猴免疫调节作用及Th17分化的机制研究

【摘要】目的：中药注射液“喘可治”(简称喘可治)由淫羊藿和巴戟天两味中药研制而成,临床已证实可治疗哮喘。应用喘可治对艾滋病猴模型进行干预,探讨喘可治对艾滋病毒慢性感染的免疫调节作用及对Th17细胞分化的机制,为研究温阳补肾类药物对免疫调节的作用奠定基础,为从免疫调节角度发展新的治疗HIV/AIDS方案、研发新的药物提供实验依据。方法：12只猴免疫缺陷病毒(SIV)慢性感染(感染9-22月)的中国恒河猴,分为治疗和对照组,每组各6只,分别肌肉注射喘可治和生理盐水2个月。于给药前(第0天)、给药第4周和第8周采集外周血、活检淋巴结,检测以下各项指标：首先,应用实时荧光定量PCR(Realtime-PCR)检测猴血浆SIV载量和流式细胞技术检测T淋巴细胞CD4、CD8亚群这两个公认的艾滋病治疗评价指标,以及采用《恒河猴症状体征量化计分表》观察治疗组和对照组的艾滋病猴临床症状和体重变化,客观评价喘可治治疗艾滋病猴的疗效。其次,探索喘可治对艾滋病猴模型T细胞亚群、表型及淋巴组织结构的影响。①应用流式细胞技术检测外周血单个核细胞(PBMC)中Th17(CD4/IL17A标记)和Treg(CD25/Foxp3标记)细胞比例、数量及Th17/Treg比值的动态变化；②应用流式细胞术检测PBMC中T细胞的初始／记忆亚群(CD28/CD95标记)、增殖(Ki67标记)与活化(HLA-DR和CD69标记)T细胞的比例,并计算细胞数,探讨其变化规律；③应用活检的淋巴结做常规HE染色；Ki67免疫组化来观察淋巴结内细胞增殖的情况；网状纤维染色(银染)、Masson染色和胶原蛋白(CollagenⅠ)染色来观察淋巴结组织结构及纤维化的情况；结蛋白(Desmin)的免疫组化染色来观察淋巴结内成纤维网状细胞网络的情况,以系统评估喘可治治疗对淋巴组织结构方面的影响。最后,重点研究喘可治对艾滋病猴模型调节Thl7细胞分化的作用机制。①活检淋巴结分离的细胞悬液以流式细胞法检测Thl7、Treg亚群的改变,以验证与外周血中的改变是否相符；②为研究喘可治对艾滋病猴模型Thl7细胞分化的调节机制,流式细胞法检测淋巴结细胞表达细胞因子TGF-、IL-10、IFN-γ的变化,免疫组化的方法检测淋巴结TGF-β的表达情况；③应用Real-timePCR法检测Th17相关的转录因子IL-17A、RORc、RORa、IL-21、AhR、IFN-r、IL-2、T-box21的变化,探求喘可治调节Thl7细胞分化的信号通路。④应用流式细胞法检测B细胞及其亚群的改变,ELISA检测血浆内毒素(LPS)含量,以了解喘可治对B细胞和肠道微生物转位的影响,用猴SIVIgG抗原片检测SIVIgG抗体。结果：(1)喘可治治疗艾滋病猴模型疗效评价结果：①艾滋病猴模型的临床症状观察：从第4周开始,治疗组的症状积分较治疗前降低,该组恒河猴精神活动度较好,部分恒河猴的纳差、腹泻症状较前好转,艾滋病症状有所改善；而对照组的症状积分逐渐增加,部分恒河猴精神状态较差,食量减少、出现反复的腹泻。两组时间与处理的交互效应接近显著性差异值(P=0.082)。提示喘可治能改善艾滋病猴精神、纳差、腹泻等临床症状。②血浆SIV病毒载量变化：在观察期间,治疗组和对照组各动物血浆病毒载量大多在104-106拷贝数/ml间,基本保持平稳,两组无统计学差异(P>0.05)。③外周血T淋巴细胞CD4、CD8亚群变化：治疗组和对照组的CD4、CD8和CD4/CD8比值随时间变化基本一致,两组无统计学差异(P>0.05)。(2)喘可治对艾滋病猴模型T细胞亚群、表型及淋巴组织结构的影响：①外周血和淋巴结Th17细胞变化：喘可治治疗第4周时,外周血Th17细胞(CD4+IL17+)的数量降低(P=-0.032),治疗8周时仍维持下降趋势,而对照组Thl7细胞数量有增加趋势。结果与淋巴结Th17细胞变化基本一致。还有趣的发现,在CD4阴性的细胞中IL-17的表达并无减少,提示喘可治选择性的下调了Th17细胞。②外周血和淋巴结Treg细胞变化：喘可治治疗4周时,外周血CD25+FoxP3-CD25-FoxP3+和CD25+FoxP3+(Treg细胞)三个群体的细胞数量和比例均有不同程度的下降,在第8周时以CD25+FoxP3+(P=0.028)和CD25+FoxP3-(P=0.043)两群下降明显,而对照组略有上升。两组的CD25-FoxP3+细胞数量无统计学差异(P>0.05)。结果与淋巴结Treg细胞变化基本一致。提示喘可治可使Treg细胞减少。③外周血和淋巴结Thl7/Treg比值变化：在第4周时,治疗组Th17/Treg比值下降,对照组的变化不明显,两组统计学无明显差异(P>0.05)。提示喘可治可能下调Thl7/Treg比值。④CD4初始／记忆亚群变化：治疗组和对照组的初始型CD4、效应型记忆CD4和中央型记忆CD4随时间变化不明显,两组统计学无明显差异(P>0.05)。提示喘可治治疗后Th17细胞的减少并不是由于初始CD4细胞减少导致的。⑤CD4细胞早期／晚期活化情况：治疗组和对照组的早期活化细胞(CD4+HLA-DR+)数量变化基本一致。两组的晚期活化细胞(CD4+CD69+)变化趋势不同,治疗组从第4周开始晚期活化细胞减少,而对照组略有增加,两组统计学无明显差异(P>0.05)。提示喘可治未引起CD4细胞活化增加。⑥CD4细胞增殖情况：从第4周开始,治疗组CD4细胞增殖减少,对照组CD4细胞增殖增加,两组无统计学差异(P>O.05)。提示喘可治未引起CD4细胞增殖增加。⑦病理HE结果：喘可治治疗后,有5只猴淋巴结结构保存良好,处于增生、退化状态,仅有一只猴淋巴结进入耗竭；而对照组有5只猴淋巴结结构呈现退化和耗竭状态。治疗组生发中心活跃,滤泡结构较为规整,副皮质区增厚；对照组淋巴结生发中心减少或消失,滤泡结构不完整,副皮质区域始滤泡结构不完整。⑧病理免疫组化和特殊染色结果：治疗组淋巴结滤泡周围成纤维网状细胞结构(FRC)有序并增多；胶原纤维在副皮质区的高内皮血管周围明显减少；胶原蛋白I(CollagenⅠ)沉着减少。而对照组滤泡周围网状纤维不完整并减少；胶原纤维和CollagenⅠ无明显改变或有增加趋势。(3)喘可治调节艾滋病猴模型Th17细胞分化的机制及影响：①淋巴结TGF-β表达情况：喘可治治疗第8周,TGF-β在T细胞的表达减少,在非T细胞群体中减低更为明显；而对照组TGF-β变化不明显,或有上升趋势,两组间统计学无明显差异(P.0.05)。结果与淋巴结免疫组化的变化基本一致。提示喘可治可能降低TGF-β的表达。②淋巴结IL-10表达情况：喘可治治疗8周时,IL-10表达明显增加(P=-0.034),而对照组IL-10表达有减少趋势。提示喘可治可使IL-10表达增加。③Th17相关内源性转录因子表达结果：治疗组T-box21和AhR在从第4周开始表达均有下降趋势,而对照组无变化或有上升趋势；两组IL-17A、IL-21、RORa、RORC在第4周无明显差别,但在第8周治疗组的表达下降大于50%,而对照组的表达变化不明显。治疗组IL-2与其他指标的变化相反,在第4周表达上升,第8周表达下降。治疗后IFN-γ表达变化不明显(与流式结果基本一致)。提示喘可治对RORa、RORc、AhR、T-box21、IL-17A、IL-21转录因子的表达均有不同程度的下调作用,对IL-2有上调作用,对IFN-γ无明显作用。④外周血B细胞变化：喘可治治疗第8周细胞数量减少较对照组明显,主要以组织样记忆B细胞、活化成熟B细胞和静息记忆B细胞的减少为主,而对照组无明显变化,两组间无统计学差异(P>0.05)。提示喘可治可能使B细胞减少。⑤血浆内毒素(LPS)ELISA结果：感染SIV的恒河猴LPS水平明显高于健康猴(P<0.05)。喘可治治疗后LPS未见增加,而对照组略有增加趋势,两组间无统计学差异(P>0.05)。提示喘可治治疗不会引起内毒素增加。结论：(1)喘可治治疗后艾滋病猴的临床症状有所改善,精神和活动度状态好,纳差、腹泻较前好转,但对SIV病毒载量和CD4细胞数量无明显作用,提示喘可治治疗艾滋病的疗效可能不是体现在降低病毒载量和CD4细胞的指标上。(2)喘可治同时降低外周血和淋巴结中Th17和Treg细胞,提示喘可治引起的Th17和Treg细胞的减少是机体系统性变化；由于Th17和Treg细胞之间存在竞争分化,推测喘可治至少部分作用于二者分化的上游；虽然Treg细胞减少,但未引起T细胞活化和增殖增加,并且Th17/Treg比值降低,提示喘可治以Th17细胞减少为主导作用。(3)喘可治起到抗炎作用同时可改善免疫耐受：喘可治使SIV慢性感染猴的Thl7细胞降低,血浆检测内毒素未增加,推测可降低炎症反应,起到抗炎作用,并且不会引起肠道微生物移位；喘可治能降低SIV感染动物的Treg细胞,推测喘可治可减少HIV引起的免疫耐受,提示我们以改善免疫抑制为作用靶点,有望研发出新的治疗策略和药物。(4)喘可治主要通过下调内源性转录因子RORa和RORc调控Th17的分化；通过下调TGF-β、IL-21表达抑制Th17细胞分化的关键环节；通过增加IL-10表达可抑制IL-17,起到抗炎作用；下调T-box21表达,可能抑制了Thl和Thl7细胞中间状态的上游；下调芳香烃受体(AHR),可能是Th17和Treg细胞同时下降的原因；下调IL-2表达,对Th17细胞分化产生抑制作用。提示喘可治通过介导的TGF-β、IL-10和内源性RORa、RORc、AhR、T-box21、IL-17A、IL-21、IL-2多个信号分子降低Th17细胞的分化。(5)喘可治使B细胞减少,以组织样记忆B细胞和活化型成熟B细胞亚群减少为主,同时发现淋巴结滤泡结构形态规整,由于淋巴结滤泡是Thl7细胞诱导B细胞分化产生自身抗体的重要部位,推测喘可治使Th17细胞减少可改善机体的自身免疫,需进一步研究。(6)喘可治使淋巴结结构保持良好,生发中心活跃,滤泡结构较为规整,副皮质区增厚,滤泡周围的成纤维网状细胞(FRC)结构有序,胶原蛋白沉积和胶原纤维减少,喘可治可改善艾滋病猴淋巴结纤维化。结果证明,经“喘可治”治疗后,艾滋病猴模型的临床症状确有一定程度的改善,虽然未发现使病毒载量下降或提高CD4细胞数,但是我们发现喘可治是通过其他机制对艾滋病猴模型进行免疫调节。喘可治可同时使SIV感染动物的Th17和Treg细胞减少,并以Th17减少为主,发挥抗炎作用,并且不会引发微生物转位。其机制是喘可治作用于Thl7细胞分化环节：降低TGF-p、增高IL-10表达；对内源性转录因子RORa、RORc、AhR、T-box21、IL-17A、IL-21均有不同程度的下调作用,相反对IL-2有上调作用,对IFN-Y无明显作用。同时,我们发现喘可治也可使B细胞减少,与淋巴结滤泡形态结构改善相关。喘可治使淋巴结生发中心形态较为规整,滤泡周围网状结构有序,胶原蛋白和胶原纤维减少,推测喘可治可改善艾滋病猴模型淋巴结纤维化。这也提示我们,除了病毒载量和CD4两项指标外,对中医药治疗艾滋病是否存在疗效可能需要更完善的评价体系。本研究围绕Th17细胞探讨温阳补肾药喘可治对慢性SIV感染的免疫系统的调节及机制,发现喘可治可通过介导的TGF-β、IL-I0和内源性RORa、AhRC、T-box21、IL-17A、IL-21、IL-2多个信号分子降低Th17细胞的分化。同时,本研究通过对喘可治的研究,首次从Th17细胞免疫方面探讨温阳补肾药的作用机制,对中医温阳补肾药共性的机理研究是一个重要的补充和完善。
【作者】陈滢宇；
【导师】符林春；
【作者基本信息】广州中医药大学，中医临床基础，2014，博士
【关键词】猴免疫缺陷病毒；Th17细胞；调节性T细胞；喘可治；淫羊藿；巴戟天；温阳补肾；疾病模型；动物；中国恒河猴；

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