铁皮石斛良种繁育与GAP种植关键技术研究

【摘要】目的：铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraetMigo)为兰科石斛属多年生附生型草本植物,为我国传统的名贵中草药,具有益胃生津、滋阴清热等功效。现代药理研究表明铁皮石斛具有抗肿瘤、抗衰老、增强机体免疫力、扩张血管及抗血小板凝集等作用,因此在临床、中药复方和保健品中被广泛应用。为满足我国药品和保健市场对铁皮石斛的需求,更好地保护和发展铁皮石斛野生资源,将野生铁皮石斛变为家种,开展良种繁育及栽培技术研究,建立规范化种植(GAP)基地是保障铁皮石斛资源可持续利用的重要举措。近年来铁皮石斛组培苗工厂化生产亦趋于成熟,主要运用组织培养技术来进行无菌播种繁育,其具有繁殖系数高、去病毒、生产不受季节限制等优点,但试管苗生产周期长、易发生变异,生产上对培养基中激素成分无严格控制,且继代次数过多会出现生存力及产量下降,因此有必要建立铁皮石斛高效离体再生繁育体系,从有性繁育及无性繁育途径对试管苗生长进行有效控制,生产出健壮、生长一致的优良种苗。此外,由于铁皮石斛试管苗的组培生产操作繁杂、成本高,不便于贮藏和运输等,人工种子技术的诞生为珍稀紧缺的铁皮石斛药材产业化生产提供了一条新的途径,且纳米Ti02材料有一定的激素效应和抑菌作用,利用其制作铁皮石斛人工种子的复合胚乳和人工种皮,有望能改善传统包埋的透气性、保水性,减少萌发过程中的污染情况,提高人工种子的萌发率和成苗率,从而为铁皮石斛人工种子实用化和产业化发展提供技术支持,并通过规模化应用快速繁育铁皮石斛优良种质。目前铁皮石斛工业化生产主要通过无菌种子播种模式,种子经原球茎繁育得到大量的试管苗,但其变异较多、质量参差不齐,种植者仅在乎产量的多少,并不在乎种苗是否优质,而且目前铁皮石斛与石斛属其他植物杂交制种混乱导致种苗的变异程度更大。铁皮石斛优良品种是获得优质药材的根本保证之一,为了获取优质的铁皮石斛药材,因此有必要采用育种手段进行优良品种选育。以离体培养为基础的快速育种技术,包括自发变异与人工诱变方法,可使品种选育工作突破了时间、季节及土地规模的限制,对优良种质的选育具有重要的意义。本研究开展铁皮石斛高效离体繁殖、良种选育及GAP种植技术探索,初步选育出优良品种,且制定标准化生产操作规程(SOP),从而为保障铁皮石斛资源可持续利用奠定重要基础。方法：本研究开展铁皮石斛高效离体再生繁殖、良种繁育及GAP种植关键技术的研究,具体包括以下方面：(1)在组织培养的基础上,依据不同生长调节剂、有机添加物、纳米材料的特殊激素效应和促生长性能等,探讨其对铁皮石斛高效离体再生繁育体系的影响,其中包括有性繁育与茎段无性繁育两种途径,为缩短试管苗生产周期、减少成本、提高移栽成活率及培育高效、高产的铁皮石斛奠定基础。(2)以纳米材料Ti02构建铁皮石斛人工种子,探讨不同人工种皮基质、是否添加保水剂对人工种子制作的影响,分析不同纳米Ti02浓度、包埋方法、接种培养基、交换时间等对萌发率与转株率的影响,同时运用生物学特征、植物生理学检测人工种子萌发苗的生长状况。(3)采用现代育种技术对铁皮石斛进行离体选择育种,包括自发变异及人工诱变,其中人工诱变方法采用秋水仙素及紫外线辐射诱变,运用生物学特征、细胞学观察及流式细胞技术鉴定多倍体铁皮石斛,初步筛选出铁皮石斛优良品种。(4)对铁皮石斛基地环境质量进行考察,通过离体快繁技术,依据试管苗的生长动态对铁皮石斛试管苗进行质量分级评价；并进行了铁皮石斛种苗的移栽技术、施肥原则、病虫害及防治、采收初加工等方面的GAP种植关键技术研究,初步制定出铁皮石斛标准化生产操作规程(SOP)。结果：1、铁皮石斛高效离体再生繁育体系野生铁皮石斛种子接入MS培养基中进行无菌培养,结果显示随着培养时间的增加,种子的萌发度逐渐增加,大小由粉状、芝麻粒状到绿豆状生长,到90d原球茎基本全部分化；较理想的铁皮石斛原球茎增殖培养基为MS+KT2.0mg/L;较理想的铁皮石斛原球茎分化培养基为MS+KT1.0mg/L+NAA0.2mg/L+10%椰乳+0.3%活性炭；较理想的铁皮石斛壮苗生根培养基为：1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA2.0mg/L+20%香蕉汁+硝酸铈20mg/L。综合考虑污染率、发芽率两方面,铁皮石斛茎段灭菌效果最好为消毒后去除叶鞘法；不同产地铁皮石斛茎段诱导侧芽的发芽率与不定芽生长情况存在一定的差异；MS培养基综合加入不同生长调节剂(NAA、6-BA)、纳米材料(Ti02、Si02)与添加物(番薯汁、沙葛汁),并不利于铁皮石斛茎段诱导侧芽；不同来源的铁皮石斛茎段对于培养基加入噻苯隆(TDZ)诱导侧芽的反应存在显著性差异,而同一来源的铁皮石斛茎段对于不同浓度TDZ诱导侧芽的反应无显著性差异。2、铁皮石斛人工种子研究铁皮石斛人工种子的制作,人工胚乳以4%海藻酸钠结合2%木薯淀粉为宜；添加1.0g/L保水剂对降低人工种子的失水能力无显著性影响,但可以稍微增加失水后人工种子的复水能力；纳米Ti02溶胶颗粒已达到纳米级,且在溶胶中分布均匀；添加5%纳米Ti02对铁皮石斛人工种子萌发苗的生长具有显著的促进作用；海藻酸钙球法制备铁皮石斛人工种子的效果优于中空海藻酸钙球法；播种于1/2MS培养基的铁皮石斛人工种子效果优于琼脂培养基质；人工胚乳与2%CaCl2交换交换时间为15min为佳；随着加入纳米Ti02的增加,铁皮石斛人工种子萌发苗的根系活力逐渐增加、硝酸还原酶活性逐渐增加、总SOD活力先上升后下降、POD活力逐渐上升、CAT活力逐渐上升、T-AOC活力逐渐上升。3、铁皮石斛育种技术研究铁皮石斛二倍体植株的染色体为38条；最佳流式细胞术条件为叶片150mg、Otto提取缓冲液3mL、2000r/min离心8min、PI含量37.5μg/mL、孵化30min。实验室中29种铁皮石斛试管苗在欧氏距离的水平上划分为3类,经流式细胞仪检测发现离体培养自发变异率为41.38%(12/29),四倍体细胞含量均>50%。第一类试管苗中有75%植株的四倍体细胞含量>70%,植株表现为分蘖数多、茎较粗、叶数多、叶较宽、根数多,符合四倍体植株的形态特点；而第二类试管苗的四倍体细胞含量均>50%,植株表现为株高、分蘖数、叶宽、根数中等,叶片与根部较长。通过秋水仙素诱变方法发现,铁皮石斛原球茎经秋水仙素浓度≥0.2%处理≥72h后,铁皮石斛再生苗植株体主要为四倍体细胞,四倍体细胞含量均超过70%；而小芽经秋水仙素浓度≥0.05%处理≥96h后,再生苗植株体主要为四倍体细胞,四倍体细胞含量均超过50%。通过紫外线辐射诱变方法发现,紫外线可以显著促进铁皮石斛原球茎萌发芽的生长,其最佳辐射时间为4min,辐射2-4min对原球茎的膨大作用明显,但紫外线照射距离43cm、辐射10mmin以内对铁皮石斛原球茎无明显的诱变效应。4、铁皮石斛GAP关键技术研究本研究建立了铁皮石斛GAP种植关键技术措施,种苗具有成活率高、生长快、产量高等特点。通过铁皮石斛GAP种植技术研究,本基地环境质量标准均符合国家标准,收集不同来源的铁皮石斛种质资源,了解种子无菌播种后生长7-9个月组培苗的生长动态,并初步对铁皮石斛种苗质量分级进行评价,建立了本基地移栽技术、施肥原则、病虫害防治、采收加工等方面的铁皮石斛种植SOP。结论：在铁皮石斛离体培养形态建成过程中,主要包括有性繁育(无菌种子播种→原球茎增殖→原球茎分化→小芽壮苗与生长)与无性繁育(茎段接种→侧芽诱导→侧芽发育)2种途径,而某些激素(或添加物、纳米材料)对铁皮石斛的某一生长发育阶段能起促进作用,实际上单一激素(或添加物、纳米材料)的浓度效应既受其他激素作用的影响,还取决于本身在特殊作用位点的浓度及植物细胞对它的敏感性。对铁皮石斛整个生长发育过程来说,各种激素(或添加物、纳米材料)起着协同互作的作用。对于实际生产而言,合理地使用激素比例十分重要。将人工种子技术引入铁皮石斛快繁体系中,以纳米材料构建铁皮石斛人工种子,建立生产周期短、生产成本低的无性繁殖生产体系,从而解决铁皮石斛的商业化生产问题,为铁皮石斛的产业化发展提供技术支撑。探讨铁皮石斛离体选择育种,初步将实验室试管苗分为三大类,采用秋水仙素、紫外线辐射诱变手段初步筛选出铁皮石斛的多倍体植株,但大多为嵌合体,仍需进一步的分离纯化。通过建立铁皮石斛GAP种植关键技术措施,运用离体快繁技术初步形成铁皮石斛良种繁育体系,初步评价了铁皮石斛种苗质量分级,制定了移栽技术、施肥原则、病虫害防治、采收加工等方面的铁皮石斛种植SOP,但均尚需深入研究探讨,确保优质种苗供应生产,以解决大规模生产所需种苗问题。目前铁皮石斛快速繁育技术已基本解决,但良种选育仍未完全解决,优良品种需要品种筛选、移栽种植后申请鉴定,由于时间关系,尚需进一步的探讨与深入研究。
【作者】关杰敏；
【导师】赖小平；
【作者基本信息】广州中医药大学，中药学，2014，博士
【关键词】铁皮石斛；离体快繁；人工种子；多倍体选育；GAP种植；

【参考文献】
[1]赵克友.有结构摄动非线性系统的鲁棒绝对稳定性[J].自动化学报,1993,02:138-144.
[2]李幼寰,王秀兰.53MnS钢的生产试制[J].一重技术.2007(02)
[3]邵星灵,王宏伦.线性扩张状态观测器及其高阶形式的性能分析[J].控制与决策.
[4]张伟丽.张家窝镇经济发展战略研究[D].天津大学,公共管理,2013,硕士.
[5]王茜.大学文化与高校德育的共融互动研究[D].鲁东大学,思想政治教育,2014,硕士.
[6]郭晓赟.经理股票期权会计问题研究[D].天津财经学院,会计学,2004,硕士.
[7]申耀锋.和谐社会视野下中国利益分化现象研究[D].河北师范大学,马克思主义基本原理,2012,硕士.
[8]汪震龙.基于复杂系统动态贝叶斯模型的我国上市公司资本结构影响因素的研究[D].厦门大学,统计学,2014,硕士.
[9]杨军义.乐观特质的脑结构基础及其对焦虑的作用机制[D].西南大学,基础心理学,2014,硕士.
[10]闫素丽,皇甫超河,李刚,左照江,马杰,杨殿林.四种牧草植物替代控制对黄顶菊入侵土壤细菌多样性的影响[J].植物生态学报,2011,01:45-55.
[11]臧国心,戴天虹,李明哲.TESP:带时间特征的序列模式挖掘算法[J].黑龙江工程学院学报,2004,02:5-9.
[12]彭晓春.英汉委婉语的比较研究[D].华南师范大学,英语语言文学,2003,硕士.
[13]杨治.基于实例推理的软件设计模式复用方法的研究[D].华中师范大学,2005.
[14]牟志刚,杜玉扣,杨平.卟啉/石墨烯/铂纳米粒子复合物阵列的制备和光催化性能研究[A].中国化学会.中国化学会第27届学术年会第11分会场摘要集[C].中国化学会:,2010:1.
[15]杨婕.综合业务接口板时钟控制电路的设计与实现[D].西北工业大学,导航、制导与控制,2004,硕士.
[16]张洁洁.国际社会对中国道路的评价与坚定道路自信研究[D].华中师范大学,科学社会主义与国际共产主义运动,2014,硕士.
[17]丁科.2，4’-DDT、氟乐灵对斑马鱼内分泌干扰效应研究[D].南京农业大学,环境工程,2012,硕士.
[18]郑金龙.黄连混合生物碱转化为单体巴马汀的研究[D].长春工业大学,化学工程,2013,硕士.
[19]赵坤.中国饮食名称异化翻译策略研究[D].西安工业大学,外国语言学及应用语言学,2014,硕士.
[20]齐秀华.唐山水资源管理问题与对策研究[D].西南交通大学,公共管理,2013,硕士.
[21]张敏芝.医院信息化建设研究[D].苏州大学,公共卫生（专业学位）,2012,硕士.
[22]李玉梅.框架：一个徘徊在新闻策划之后的幽灵[D].华中师范大学,新闻学,2004,硕士.
[23]孙慧玲.我国电子信息产业结构分析与评价[D].吉林大学,情报学,2004,硕士.
[24]曹学禹.联合测定法测定液塑限的试验研究[D].长安大学,道路与铁道工程,2013,硕士.
[25]李幸.论汤汤童话中的鬼魅世界[D].东北师范大学,中国现当代文学,2012,硕士.
[26]董明.量子点修饰TiO_2/SiO_2/Fe_3O_4纳米粒子的制备及其光催化特性研究[D].湖北大学,材料物理与化学,2012,硕士.
[27]李丹丹.认知网络中具有自主学习特征的智能QoS保障机制研究[D].北京交通大学,2013.
[28]杨东.高效LED驱动电源的设计[D].南京理工大学,电子与通信工程,2012,硕士.
[29]刘航飞.城市供水系统分区及管网优化研究[D].长安大学,建筑与土木工程（专业学位）,2014,硕士.
[30]徐朦,郑凯.我国物流企业信用监管难点分析:基于产业经济学的视角[J].特区经济,2014,12:202-204.
[31]李吉来.民营资本介入古村镇遗产保护与旅游开发的商业模式研究[D].华东师范大学,旅游管理,2013,硕士.
[32]周振宇.基于双退化各向异性扩散方程的乘性去噪模型研究[D].哈尔滨工业大学,计算数学,2014,硕士.
[33]张赟霞.TD-SCDMA智能天线研究[D].南京理工大学,电子与通信工程,2012,硕士.
[34]王博.钯及其合金的纳米化在甲酸阳极氧化催化中的应用[D].黑龙江大学,2014.
[35]孟大志.奥运场馆中临时商业网点设计中的数学模型化方法[J].工程数学学报,2004,07:71-75.
[36]李志卿.基于轮廓查询的实体排序算法的研究[D].东北大学,计算机应用技术,2010,硕士.
[37]梁源.陈铭志钢琴音乐研究[D].东北师范大学,音乐学,2012,硕士.
[38]王国民.SnO_2乙醇传感器制备[D].黑龙江大学,微电子学与固体电子学,2013,硕士.
[39]王莉.草鱼甘露糖受体基因的克隆与表达分析[D].华中农业大学,水产养殖,2014,硕士.
[40]张崇辉.环境污染与经济增长的关系研究[D].浙江工商大学,统计学,2012,硕士.
[41]张良义.卷取机力矩系统调张范围的探讨[J].冶金自动化,1984,04:24-28.
[42]秦来芬.磷酸锰锂正极材料的改性研究[D].宁波大学,2014.
[43]李秀丽.珠江三角洲渔业水域多氯联苯残留及污染评价[D].上海海洋大学,水生生物学,2013,硕士.
[44]刘军培.SNS学习型社区中兴趣搜索机制的研究[D].大连海事大学,计算机科学与技术,2013,硕士.
[45]钟秀玉.计算机取证技术探讨[J].现代计算机(专业版),2005,01:46-49.
[46]张斌.我国民事执行的困境及其应对[D].黑龙江大学,法律,2012,硕士.
[47]刘家军.ZL205A高强铝合金铸件腐蚀行为研究[D].哈尔滨工业大学,材料加工工程,2014,硕士.
[48]韩广兴.视频光盘机技术(五)——视频光盘机的系统控制电路[J].今日电子.1994(05)
[49]唐寅婉.城市森林公园环境解说有效性评估研究[D].北京林业大学,旅游管理,2013,硕士.
[50]胡文莉.大断面型材曲柄式飞剪机的优化设计及关键技术研究[D].太原科技大学,机械设计及理论,2013,硕士.