岗梅转录组及三萜皂苷生物合成相关酶基因的挖掘

【摘要】三萜皂苷是广泛存在于植物界中的一类具有丰富生物活性的次生代谢产物。三萜皂苷的皂苷元具有多种不同的构型。其中四环三萜和五环三萜是最为常见的三萜类化合物,它们因具有显著的生物活性而成为药物开发的目标。然而,由于三萜皂苷的化学结构复杂,提取分离难度大,进而妨碍了对其开发利用。三萜皂苷的生物合成相关酶基因的鉴定有助于从分子水平揭示其合成机制,为人工合成这类重要化合物奠定理论基础,近来年相关的科研报导日益增多。以齐墩果烷(或β-香树脂素,β-amyrin)型三萜皂苷为代表的五环三萜的生物合成是研究热点之一,而其同分异构体乌索烷(或α-香树脂素,α-amyrin)型三萜皂苷的研究却很少见。岗梅是岭南地区常用的中药材之一,来源于冬青科植物秤星树Ilexasprella(Hook.etArn.)Champ.exBenth.的根,目前资源日益紧缺。岗梅主要含三萜类化合物。在这三十几个三萜类化合物中,除了齐墩果酸是β-amyrin构型,其余均为α-amyrin构型。这使得岗梅成为研究乌索烷型三萜皂苷生物合成的理想材料。本文利用目前国际前沿的组学技术——转录组学方法挖掘岗梅乌索烷型三萜皂苷的生物合成相关基因,并对部分候选基因进行克隆和功能分析,为进一步阐明三萜皂苷生物合成的机制,从而为岗梅的种质和品种改良提供实验基础。进一步的实验内容和结果如下：1岗梅根的转录组测序利用第二代高通量测序技术—-IlluminaHiSeqTM2000对该岗梅根进行转录组测序,获得一个包含丰富生物信息的转录组数据库,数据库容量为3.98Gb。获得51,865条unigenes,其中39,269条unigenes至少在一个公共数据库(Nr、Nt、Swiss-Prot、KEGG、COG和GO)中获得注释,注释率75.71%。2三萜皂苷生物合成途径推测在岗梅根转录组数据中,有272条unigenes(约1.30%)被注释为参与萜类的生物合成息息相关的5条代谢通路中。进一步,本研究进行了基于已鉴定基因的同源性比对来深入发掘可能参与三萜皂苷的生物合成途径的候选基因。结果共获得了97条候选unigenes。其中上游途径包括：22条可能参与MVA途径、23条可能参与MEP途径和26条可能编码中间体(如DMAPP、GPP、GGPP和FPP等)合成酶的候选unigenes;下游途径包括：可能编码环氧角鲨烯合成酶(OSCs)、细胞色素P450单加氧酶(CYP450s)和糖基转移酶(UGTs)的unigenes分别有9条、11条和6条。利用MEGA软件对三萜皂苷生物合成途径中的几个关键酶的候选基因做进化树分析,建立了这些候选基因与其他物种同源基因的亲缘关系和进化关系。这些候选基因可用于后续的功能分析和蛋白表达分析。3三萜皂苷生物合成途径下游基因的表达水平分析针对转录组数据中筛选出来的岗梅三萜皂苷生物合成下游途径6个关键环节的候选unigenes,以α-tubulin为内参基因,利用实时荧光定量PCR检测各unigenes在岗梅不同组织部位(根皮、根木质部、茎皮、茎木质部、嫩叶、成熟叶、须根和枝)的表达水平。实验结果表明,IaFPPS2187、IaSS6896和IaSM3649在各组织部位中均有明显表达,表达量与内参基因相近；3个OSC中,IaOSC3079的表达量在所有目的基因中最高,而其他两个则表达量极低；2个CYP450s和2个UGTs也都有较低的表达。同时,实验还同时检测了这8个不同组织部位的总皂苷含量,并对调控基因的表达量与化学成分代谢规律进行探讨：岗梅在各个组织部位中均可合成三萜皂苷；三萜皂苷主要贮存在根部和叶子；茎的贮存量很低,可能为三萜皂苷的转运通道。4AmyrinSynthases的克隆和功能分析在9个注释为OSCs中,unigene105被注释为α-amyrin合成酶,而两个包含全长CDS的unigenes(CL3079.Contig1和CL481.Contig1)被注释为β-amyrin合成酶(分别命名为IaAS3079和IaAS481)。通过T-A克隆和GATEWAY技术构建了带特异性标签的IaAS3079和IaAS481的酵母表达载体,在酿酒酵母中进行表达和功能分析。Western-blot证明了IaAS3079在酿酒酵母中成功表达了,而未检测到与IaAS481预期大小相近的蛋白条带。用GC-MS分析酵母提取物,发现表达IaAS3079和IaAS481的酵母提取物中均可发现α-amyrin和β-amyrin,二者的比例不同,说明IaAS3079和IaAS481均为多功能AS.IaAS3079的合成产物以α-amyrin为主,约占80%；而IaAS481的合成产物则以β-amyrin为主,约占95%。利用RACE技术成功扩增得到了unigene1015的3’端方向800bp左右的缺失片段,包括3’端编码区和polyA尾；而5RACEPCR却没有获得预期结果。本论文利用生物信息学分析和基因工程技术等,从岗梅根转录组数据库中筛选鉴定了一系列可能参与三萜皂苷生物合成相关的候选基因。对这些候选基因的进一步研究,有助于从基因水平揭示岗梅中乌索烷型三萜皂苷的生物合成。乌索烷型三萜皂苷是岗梅的主要化学成分,且具有抗肿瘤和抗病毒等生物活性,可能是岗梅的药效物质基础。从分子水平研究乌索烷型三萜皂苷的生物合成,可以为岗梅的生物代谢工程调控奠定基础,进而为岗梅的种质生物化学研究提供新的研究思路。
【作者】郑夏生；
【导师】陈蔚文；徐晖；
【作者基本信息】广州中医药大学，中药学，2014，博士
【关键词】岗梅；转录组；三萜皂苷；生物合成；基因克隆表达；

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