慢性HBV携带者肝细胞内HBcAg分布状态及补肾法的干预效应

【摘要】背景和目的众所周知,慢性HBV感染有四个阶段：免疫耐受期、免疫清除期、非活动复制期和再活动期。很多学者认为,慢性HBV感染四阶段与肝细胞内HBcAg分布状态密切相关,而肝细胞内HHBcAg分布又与病情轻重、病毒载量、治疗应答相关联,并影响着慢乙肝的进程和转归。目前在临床上,人们依赖病理学家的知识和经验来判断HBcAg的表达和分布,然而,由于病理切片自身的问题和主观经验的限制,常常出现主观偏倚。而且,肝细胞内HBcAg分布临床意义的研究虽然在某种程度上基本达成共识,但进一步深入探讨,存在学术分歧的地方仍然很多。分析其原因,一是如上评价方法的客观性尚有不足,二是研究者采用的评价方法并不统一,三是病例选择差异较大。此外,从中医理论看,肝细胞内HBcAg分布与前人的“伏邪”学说能否汇通和结合?中医补肾法为主是否有一定的疗效?这也是一个值得探讨的话题。基于以上背景,本研究有4个目的：①从理论上探讨肝细胞内HBcAg分布状态引入中医伏气温病学说的可能性；②设计和验证一种较为客观的,定量的肝细胞内HBcAg分布的分层评价方法；③探讨肝细胞内HBcAg不同分布状态的临床意义(各病毒学、免疫学指标以及肝脏病理在HBcAg不同分布状态的表达情况)；④探讨补肾法治疗对肝细胞内HBcAg不同分布状态及各病毒学、免疫学指标的影响。研究方法1.资料来源：来自导师领衔主持的国家重大科技专项课题“慢性乙肝病毒携带者的证候规律及中医药治疗方案研究”[20]中429例患者的病例资料。2.切片成像与图像处理：从深圳市中医院获取免疫组化染色切片,在第三人民医院病理科进行切片拍照,判断HBcAg阳染情况,并进行图像编号、标示。应用Image-Pro-Plus图像处理软件,在HIS模式下,分别测出平均每个视野内的阳性细胞核个数、染色面积、平均光密度值,以及整个视野背景的平均光密度值。根据不同色度参数,可以得出阳性细胞浆HBcAg免疫组织化学阳性面积,亦可以分别计数HBcAg免疫组织化学阳性与阴性的细胞核。最后,分别获得]HBcAg胞浆阳性面积和胞核阳性个数的数据。3.肝细胞内HBcAg分层评价方法：通过胞浆、胞核阳染率的计算公式,统计所有病例胞浆、胞核阳染率,待统计完毕,根据胞浆、胞核阳染率数据分布特点,定量划分HBcAg表达的不同层级,并探讨HBcAg分布与一般情况及病理学、病毒学、免疫学指标的关系,从而判断其临床意义。4.血清学指标检测：血清HBVDNA定量检测采用PCRELISA全自动内标法(Roche公司COBASAmpliprepTaqMan48系统),分别在治疗开始及第24周、52周各检测1次；血清乙肝标志物HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb,采用AbottLaboratoriesARCHITECTi2000sr系统化学发光免疫法进行检测；血清Th1/Th2型细胞因子；IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α,采用ELISA方法检测。5.“补肾法”疗效观察：“补肾法”是以补肾为主兼以健脾和清透的治疗方案。补肾健脾方由仙灵脾30g、菟丝子10g、杜仲15g、怀牛膝15g、枸杞子15g、黄芪15g、白术15g、茯苓15g、猪苓10g、枳壳10g、印度叶下珠15g、丹参20g、三七5g、郁金15g组成。补肾清透方由印度叶下珠30g、菟丝子10g、仙灵脾30g、女贞子15g、旱莲草15g、柴胡10g、白芍10g、枳实10g、桃仁10g、甘草5g、虎杖15g。均每日一剂,分两次服用。进行治疗组和对照组HBcAg分布情况及病毒学、免疫学、病理学指标的对照研究,以评价其疗效。研究结果1.肝细胞内HBcAg分布特点及其临床意义(1)429例患者HBcAg胞浆和胞核阳性分布：0-2.5%HBcAg胞浆阳性表达的患者病例数最多,随着胞浆阳性表达升高,病例数逐渐减少,高于40%的阳性表达以个例情况为主；0-2.5%胞核阳性表达的患者病例数最多,超过总体样本40%,2.5-5.0%阳性表达病例数明显降低。(2)HBcAg胞浆与胞核分层情况：HBcAg胞浆阳染显示,胞浆HBcAg阳染率<0.05%设为0级,基本代表胞浆HBcAg表达阴性；0.05%<胞浆阳染率<5%设为1级,5%<胞浆阳染率<10%设为2级,10%<胞浆阳染率<20%设为3级,胞浆HBcAg阳染率>20%以上者设为4级。HBcAg胞核阳染显示,胞核阳染率=0%设为0级,代表着细胞核HBcAg表达阴性；0%<胞核阳染率<2%设为1级,2%<胞核阳染率<10%设为2级,10%<胞核阳染率<20%设为3级,胞核阳染率>20%设为4级。(3)不同性别HBcAg分布表达：男性与女性无论在HBcAg胞浆还是胞核中表达的比较,均无统计学意义(P>0.05)。(4)不同年龄段HBcAg分布表达：HBcAg胞核的表达主要集中于25-47岁,胞浆则集中在26-47岁。(5)血清HBsAg在HBcAg胞浆、胞核分布中表达：血清HBsAg滴度在0级HBcAg胞浆分布明显高于3级、4级(P值分别为<0.05,<0.01),1级、2级滴度表达皆高于4级(P值分别为<0.05,<0.05)。它在0级HBcAg胞核分布明显低于1、2、3、4级(P值分别为<0.05,<0.001,<0.001,<0.001),1级的表达明显低于2、3、4级(P值分别为<0.01,<0.05,<0.05)。(6)血清HBeAg在HBcAg胞浆、胞核分布中表达：血清HBeAg滴度在1级、3级HBcAg胞浆分布明显高于4级,有统计学意义(P值分别为<0.01,<0.05)。它在0级]HBcAg胞核分布明显低于1、2、3、4级(P值分别为<0.001,<0.001,<0.001,<0.001),1级中表达低于3级(P<0.05)。(7)血清HBVDNA在HBcAg胞浆、胞核分布中表达：血清HBVDNA载量在HBcAg胞浆分布无统计学意义(P>0.05)。它在0级HBcAg胞核分布明显低于1、2、3、4级(P值分别为<0.01,<0.001,<0.001,<0.001),1级低于2、3、4级(P值分别为<0.05,<0.01,<0.01)。(8)IL-2在HBcAg胞浆、胞核分布中表达：IL-2在0级HBcAg胞浆分布明显高于1、2、3、4级(P值分别为<0.001,<0.001,<0.001,<0.001),1级高于2、4级(P值分别为<0.001,<0.01)。它在HBcAg胞核分布无统计学意义(P>0.05)。(9)IL-4在HBcAg胞浆、胞核分布中表达：IL-4在0级HBcAg胞浆分布明显低于1、2、3级(P值分别为<0.05,<0.01,<0.001),1、2级皆低于3级,高于4级,有统计学意义(1级P值分别为<0.001,<0.01；2级P值分别为<0.01,<0.01),3级中表达高于4级(P<0.001)。它在2级HBcAg胞核分布明显高于1、3级(P值分别为<0.05,<0.05)。(10)IL-10在HBcAg胞浆、胞核分布中表达：1L-10在0、1级HBcAg胞浆分布皆高于3、4级,(0级P值<0.001,<0.05；1级P值<0.001,<0.01)2级低于1级,高于3级(P值分别为<0.01,<0.01)。它在0级HBcAg胞核分布低于1、4级(P值分别为<0.01,<0.05)。(11)IFN-γ在HBcAg胞浆、胞核分布中表达：IFN-γ在0级HBcAg胞浆分布明显低于1、2、3、4级,(P值分别为<0.01,<0.01,<0.01,<0.001)2级低于4级(P<0.05)。它在HBcAg胞核分布表达无统计学意义(P>0.05)。(12)TNF-α在HBcAg胞浆、胞核分布中表达：细胞因子TNF-(α在0级HBcAg胞浆分布明显高于1、2、3、4级(P值分别为<0.05,<0.001,<0.01,<0.001),1级高于2、4级(P值分别为<0.001,<0.01),2级低于3级(P<0.05)。它在0级HBcAg胞浆分布低于2、3级(P值分别为<0.01,<0.01),1级也低于2、3级(P<0.05,<0.01)。(13)肝组织病理在HBcAg胞浆、胞核分布中表达：423例患者炎症活动度分级与胞浆HBcAg的分布率呈正相关,GO组患者HBcAg的分布率明显低于G1、G2和G3组(P<0.01,<0.001和<0.01),G2组明显高于G1、G3组(均P<0.05),但达到G2后有下降趋势,值得进一步验证。胞核HBcAg的分布率也以G2组明显高于其他各组(均P<0.05)。肝纤维化分期在HBcAg胞浆、胞核中的表达率均无统计学意义(均P>0.05)。2.“补肾法”治疗后HBcAg表达、病理学、病毒学、免疫学指标变化(1)HBcAg胞浆、胞核阳染率变化：胞核阳染面积百分比均数下降了1.0006,但P=0.539>0.05,没有统计学意义；而胞浆阳染率百分比均数上升了5.2241,P=0.002<0.01,治疗组治疗前后,以及与对照组比较,有统计学意义。(2)肝组织病理学表达：肝组织炎症分级、纤维化分期改善(P>0.05),无统计学意义。(3)HBsAg滴度的变化：80例患者HBsAg(?)性滴度下降了21632.511U/ml,且P<0.05,有统计学意义；与93例安慰剂对照组治疗后相比,中药治疗组治疗后HBsAg阳性滴度下降了20689.3867IU/ml,且P<0.05,有统计学意义。(4)HBeAg滴度的变化：HBeAg日性表达水平下降了134.3548IU/ml,P<0.05,有统计学意义；与安慰剂对照组相比,中药治疗组治疗后HBeAg阳性表达水平比对照组低115.0866IU/ml,P<0.05,有统计学意义。(5)HBVDNA载量变化：HBVDNA指数下降了0.5638log,P<0.05,说明DNA有所下降,且具有统计学意义；与安慰剂对照组治疗后相比,中药治疗组治疗后HBVDNA指数下降了0.483log,且P<0.05,有统计学意义。(6)IL-2表达水平的变化：IL-2均数上升了22.5121pg/ml,P<0.05,有统计学意义；与安慰剂对照组治疗后相比,中药治疗组治疗后IL-2上升了21.3036pg/ml,且P<0.05,有统计学意义。(7)IL-4表达水平的变化：IL-4下降了42.5714pg/ml,P<0.001,有统计学意义,与安慰剂对照组治疗后相比,中药治疗组治疗后IL-4下降了42.0477pg/ml,P<0.01,有统计学意义。(8)IL-10表达水平的变化：IL-10下降了1.7844pg/ml,但没有统计学意义(P>0.05),与安慰剂对照组治疗后相比,中药治疗组治疗后IL-10下降了0.962pg/ml,无统计学意义。(9)TNF-α表达水平的变化：TNF-α下降了15.3377pg/ml,P<0.05,有统计学意义；与安慰剂对照组治疗后相比,中药治疗组治疗后TNF-α下降了13.3355pg/ml,P<0.05,有统计学意义。(10)IFN-γ表达水平的变化：IFN-γ上升了1.1039pg/ml,P>0.05,无统计学意义；与安慰剂对照组治疗后相比,中药治疗组治疗后IL-2上升了1.6257pg/ml,P>0.05,无统计学意义。结论1.建立在肝细胞内HBcAg胞浆、胞核阳染分布数据基础上的量化分层评价,为探讨病毒学、免疫学、病理学指标与肝细胞内HBcAg不同分布状态的关系提供了一种较为客观的方法。2.随着肝细胞内HBcAg分级的递增(胞浆、胞核阳染率的增高),HBsAg、BeAg、HBVDNA、IL-10、TNF-α以在HBcAg胞核中的表达为主,免疫细胞因子IL-2、IL-4、IFN-y则以在HBcAg胞浆中的表达为主。3.“补肾法”可以通过上调IL-2,下调IL-4、IL-10、TNF-α的表达水平,调整机体免疫状态,降低了血清HBsAg、HBeAg的滴度和HBV-DNA的载量,在一定程度上改善慢性HBV携带者的免疫耐受状态,阻止了病毒对肝细胞的继续侵蚀,包括HBVDNA载量的降低。4.根据肝细胞内HBcAg胞浆阳染率与肝组织炎症活动度呈正相关,胞核阳染率与HBVDNA载量呈正相关的定量分析,以及补肾法治疗后HBcAg胞浆阳染率上升的表现,符合伏邪“由里出表”的临床特点,说明肝细胞内HBcAg分布状态可以作为伏邪部位引入中医伏气温病理论。
【作者】聂凡；
【导师】周大桥；
【作者基本信息】广州中医药大学，中医内科学，2014，博士
【关键词】慢乙肝携带者；HBcAg量化分层评价；补肾法；伏邪理论；

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