四物汤对血虚证小鼠细胞凋亡影响的研究

【摘要】目的：观察四物汤对血虚证小鼠肝细胞、T细胞凋亡及凋亡相关基因Bax、Bcl-2和Fas表达和凋亡启动分子Caspase8、执行分子Caspase3表达的影响。方法：60只C57BL/6J小鼠随机分为空白组、模型组、四物汤低剂量组、四物汤中剂量组、四物汤高剂量组以及肌苷组。以腹腔注射环磷酰胺建立血虚证模型。模型组、四物汤低、中、高剂量组及肌苷组于实验第1d按小鼠体重0.1g/kg剂量腹腔注射环磷酰胺1次,空白组予等体积生理盐水腹腔注射。四物汤低剂量组予5g·kg-1·d-1、中剂量组予l0g·kg-1·d-1、高剂量组予20g·kg-1·d-1灌胃,肌苷组予0.06g·kg-1·d-1灌胃。空白组和模型组则予以等体积生理盐水。每日1次,连续灌胃7d。在实验第7d,给药1h后,每只小鼠眼眶后静脉丛取血,采血量约0.1mL,采用全自动血液分析仪检测外周血象。在实验第8d,颈椎脱臼处死小鼠,剖腹取肝脏、脾脏及胸腺。称量脾脏及胸腺质量以计算脾指数及胸腺指数。肝右叶切取1.Ocm×1.0cm×1.0cm组织块,以10%甲醛固定,石蜡包埋,连续切片,TUNEL法检测肝细胞凋亡。取脾脏制备淋巴细胞悬液,免疫磁珠法分离纯化T细胞,制作细胞涂片,TUNEL法检测T细胞凋亡。取肝左叶-80℃保存,以备用于总RNA和蛋白提取。荧光定量PCR法检测Bax、Bcl-2及FasmRNA表达。先将RNA逆转录cDNA,反应条件为,25℃温育10min,42℃温育50min,95℃加热5min。再取cDNA进行PCR,反应条件为95℃预变性2min,95℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸lmin,反应35个循环。循环结束后,72℃延伸5min。采集每个样品Ct值,比较各组的mRNA表达水平。Westernblot检测Caspase3、Caspase8表达。先制备SDS-PAGE凝胶,10%分离胶8mL和5%浓缩胶4mL。室温放置40min至胶凝固。再将样品蛋白和电泳上样缓冲液混合,进行蛋白变性,反应条件为95℃lOmin,然后做蛋白电泳。接着将蛋白转至PVDF膜上,反应条件为65V,2h。取出转移膜置于封闭液中,封闭1h。将封闭后的膜放入一抗中,4℃反应过夜。将反应膜用1×TBST洗涤,洗涤3次,每次10min。将洗涤后的膜放入二抗中,室温孵育1h。再用1×TBST洗涤,洗涤3次,每次10min。以电化学发光法显影,再曝光及洗片,采用凝胶成像系统,对胶片进行扫描,检测条带灰度值,做蛋白半定量分析。结果：(1)外周血象：与模型组比较,四物汤中、高剂量组及肌苷组外周血红细胞数、白细胞数以及血红蛋白含量均有升高,p<0.05,有统计学意义。四物汤低剂量组外周血红细胞数、以及血红蛋白含量均有升高,P<0.05,有统计学意义,白细胞数有上升趋势,P>0.05,无统计学意义。四物汤各剂量组血小板数有上升趋势,P>0.05,无统计学意义。肌苷组血小板数有下降趋势,P>0.05,无统计学意义。(2)脏器指数：与模型组比较,四物汤低、中、高剂量组及肌苷组脾指数均有升高,p<0.05,有统计学意义。四物汤低剂量组胸腺指数有升高趋势,P>0.05,无统计学意义。四物汤中、高剂量组及肌苷组胸腺指数有下降趋势,P>0.05,无统计学意义。(3)细胞凋亡百分率：与模型组比较,四物汤低、中、高剂量组肝细胞凋亡百分率均降低,P<0.05,有统计学意义。肌苷组肝细胞凋亡百分率有下降趋势,P>0.05,无统计学意义。四物汤中、高剂量组T细胞凋亡百分率均降低,P<0.05,有统计学意义。四物汤低剂量组和肌苷组T细胞凋亡百分率有下降趋势,P>0.05,无统计学意义。(4)凋亡相关基因mRNA表达：与模型组比较,四物汤高剂量组和肌苷组促凋亡基因Bax和FasmRNA表达水平降低,p<0.05,有统计学意义。四物汤低剂量组和中剂量组Bax和FasmRNA表达水平有下降趋势,P>0.05,无统计学意义。四物汤中、高剂量组和肌苷组抗凋亡基因Bcl-2的mRNA表达水平升高,P<0.05,有统计学意义。四物汤低剂量组Bcl-2的mRNA表达水平有上升趋势,P>0.05,无统计学意义。(5)凋亡启动和执行分子表达：与模型组比较,四物汤低、中、高剂量组和肌苷组凋亡执行分子Caspase3.启动分子Caspase8的表达水平降低,P<0.05,有统计学意义。结论：四物汤可升高血虚证模型小鼠外周血红细胞数、白细胞数以及血红蛋白含量,表明四物汤可改善血虚证模型小鼠外周血象。还可升高血虚证模型小鼠脾指数,表明四物汤可使血虚证模型小鼠免疫器官增重,对于免疫功能有改善作用。四物汤可降低血虚证模型小鼠肝细胞、T细胞凋亡百分率,其机理在于下调促凋亡基因Bax和Fas表达,上调抗凋亡基因Bcl-2表达,下调凋亡执行分子Caspase3.启动分子Caspase8的表达。综上所述,四物汤补益肝血作用机理可能与其减少细胞凋亡有关。
【作者】王正引；
【导师】全世建；
【作者基本信息】广州中医药大学，方剂学，2014，博士
【关键词】四物汤；血虚证；细胞凋亡；

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