羟基红花黄色素A抗老化作用研究

【摘要】目的：老化或衰老(Senescence)是细胞和机体成熟后的一种进行性的退化过程；随年龄的增长和／或外源性不良因素(UV辐射、光解、化学物质等)刺激的加剧,机体逐渐表现出形态和功能特征的一系列变化,同时出现相应的代偿反应。中医对机体衰老机理的研究源远流长,从《黄帝内经》到近代都有阐述和发挥,历年来诸多中医学家均认为实证血瘀与衰老的关系密切,如华佗认为“血脉流通,病不得生”；颜德馨等提出“人体衰老的本质在于气血失调、气虚血瘀”,认为“瘀是原因,虚是归宿；瘀是本质,虚是现象”。此外,韩明向更是明确提出了“血瘀致衰”的理论,认为瘀血阻滞于筋脉,使脑髓、脏腑、肌表失于濡养是机体老化的关键,而机体老化常见的呆证、癫狂、面色晦暗、肌肤出现淤斑、舌下脉络粗长、巩膜混浊、脉涩结代等皆为血瘀征象。基于以上衰老理论,近年来活血化瘀药抗衰老研究已取得较大进展,大量资料证实活血化瘀药及其活性成分对人体衰老过程中生理、病理、生化、免疫等多方面有调节和改善作用,因此活血化瘀药及其活性成分有望成为重要的抗衰老药。中药红花FlosCarthami为菊科1年生草本植物红花CarthamustinctoriusL.的干燥管状花,主产于新疆,为我国经典活血化瘀药,数千年的临床验证证实了其良好的活血化瘀疗效,目前常用于闭塞性脑血管疾病、冠心病、心肌梗塞等心脑血管疾病的治疗。红花中主要含色素、酚酸类、黄酮和脂肪油等成分,其中红花黄色素(Saffloweryellow,SY)为红花主要水溶性活血化瘀活性部位。SY为红花中多种水溶性查尔酮成分的混合物,其中含量最高、活性最强的单体成分为羟基红花黄色素A(HydroxysaffloweryellowA,HSYA),该活性单体也是我国国药准字产品—红花黄色素氯化钠注射液(批准文号：Z20050582)的主要效应成分。现代药理研究已证实HSYA在心脑血管系统、血液系统、神经系统、抗氧化、抗炎等方面具有广泛药理作用,而临床上主要用于治疗心脑血管疾病,未见有用于机体老化性疾病的报道；由此可见,具有强活血化瘀效应的单体成分HSYA在抗机体老化领域中的应用具有极大的研究价值和开发潜力。因此,本论文选择HSYA作为处理因素,针对机体老化性疾病研究领域的世界性研究热点—阿尔茨海默病、皮肤老化疾病进行药理活性研究,探讨HSYA在此类典型机体老化性疾病中发挥的保护作用,并阐明其可能的作用机制,以期为HSYA和／或红花相关中成药及制剂的临床应用开辟新的领域。方法：1.HSYA体外抗阿尔茨海默病活性研究本研究以PC12细胞为研究载体,用神经生长因子(NGF)诱导体外神经元样细胞,建立p-淀粉样蛋白(Amyloidβ-protein,Aβ)引起的神经细胞损伤模型,模拟与阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)大脑神经元病变类似的细胞模型；以HSYA为研究对象,使用形态学观察、MTT法、LDH法、Hoechst染色等方法,探讨药物的体外最佳保护浓度,评价其对损伤神经细胞的保护作用。为了深入研究HSYA对抗Aβ诱导的神经损伤的作用机理,本研究又进一步检测了该细胞内活性氧(ROS)水平以及细胞自身的氧化还原状态、线粒体膜电位、DNA碎片水平,同时分别应用RT-PCR和Westemblot方法考察了细胞PUMA及凋亡相关基因Bcl-2的]mRNA或蛋白水平的表达变化。2.HSYA抗皮肤光老化活性研究皮肤的老化包括内源性老化和外源性老化。内源性老化又称固有老化或时间老化,为不可逆过程,仅受时间和遗传信息的支配；外源性老化是指皮肤因受到环境因素的影响而产生的退变现象,在诸多环境因素中又以紫外线(Ultraviolet,UV)的影响为首,因而又被普遍称为光老化,是一种可以预防和／或治疗的皮肤老化性疾病。因此,研究领域的抗皮肤老化研究一般是指抗皮肤外源性老化(光老化)的研究。本研究以长波紫外线(UVA)联合中波紫外线(UVB)为光源,以KM小鼠为实验动物进行皮肤外源性光老化模型的制备。在此模型基础上,皮肤涂布给予HSYA对光老化皮肤进行治疗,通过小鼠背部皮肤的宏观评分、拉伸测试及重量法等方法评价皮肤含水量、弹性及松弛(皱纹)程度,探讨HSYA对紫外线诱导的光老化模型小鼠皮肤的保护作用。为了进一步研究HSYA对抗皮肤光老化的作用机理,我们进一步通过生化定量法分析小鼠皮肤组织中系列抗氧化物酶(SOD、GSH-Px、CAT)的活性,丙二醛(MDA)、羟脯氨酸(Hyp)等成分的含量,以及几种代表性基质金属蛋白酶(MMPs)的活性；此外,本研究还通过H&E染色、Gomori’s醛品红染色等实验方法,观察并分析动物皮肤表皮不规则增生的程度、胶原纤维和弹性纤维的形态、含量及分布,对其皮肤组织学的变化进行总体评价。结果：1.HSYA体外抗阿尔茨海默病活性研究体外药效评价结果显示,HSYA在20-80μM时,可剂量依赖性地对抗Ap引发的神经元样细胞损伤,维持细胞及突触的正常形态,显著提高细胞存活率,并明显降低LDH释放率,表现出显著地神经保护作用。体外作用机制研究结果表明,HSYA可显著提高Aβ损伤细胞内的GSH含量、线粒体膜电位以及Bcl-2/Bax的比值,降低细胞内MDA含量、促凋亡蛋白PUMAmRNA的表达、ROS的水平并减少DNA碎片的形成,抑制细胞凋亡。提示HSYA对Ap所致神经细胞损伤的保护作用机制,可能是通过降低ROS水平、维持线粒体膜电位水平,保持线粒体结构和功能的稳定性,抑制线粒体凋亡因子的释放,而起到保护作用；即HSYA通过影响线粒体凋亡途径,对Ap损伤的神经细胞起到重要的保护作用。2.HSYA抗皮肤光老化活性研究药效评价结果表明HSYA(100-200μg/mouse)可显著改善UV导致的皮肤干燥、松弛、粗深皱纹、结节、色素斑增多、皮革样外观等不良状态；并可明显缩短皮肤拉伸后恢复时间,提示HSYA可显著增加皮肤水和能力、保持其弹性、维持皮肤宏观正常表征。作用机制研究结果显示HSYA(100-200μg/mouse)可显著提高光老化小鼠皮肤组织中SOD.GSH-Px和CAT活性,大幅度提高Hyp的含量,显著降低MDA含量,抑制MMP-1及MMP-3的异常高表达；同时,组织病理学结果显示HSYA可明显改善UV导致的皮肤结构退形性变(尤其是胶原纤维、弹性纤维的扭曲断裂)维持胶原纤维、弹性纤维的正常分布。提示外涂HSYA可通过抗氧化作用而间接和/或直接影响基质金属蛋白酶的活性,抑制胶原降解,进而对抗反复UV辐射引发的皮肤光老化损伤。结论：本研究利用经典体外阿尔茨海默病细胞模型,率先发现HSYA具有良好的抑制Ap诱导的神经细胞毒性作用；同时,根据进一步的机制探索发现,HSYA主要通过影响线粒体凋亡途径而对Ap损伤的神经细胞起到重要的保护作用；提示HSYA在预防和／或治疗AD方面,具有潜在疗效的可能性。此外,本研究通过体内抗皮肤光老化(外源性老化)试验,发现HSYA可显著增加动物皮肤弹性、维持皮肤宏观正常表征；根据进一步的机制探索发现,皮肤涂布HSYA可通过抗氧化作用间接和／或直接调节基质金属蛋白酶活性,进而抑制胶原降解,而发挥抗皮肤光老化作用；提示HSYA具有潜在的防治皮肤光老化的功效。本研究有利于日后红花活血化瘀主要效应成分一HSYA在抗机体老化性疾病方面的开发应用,并为活血化瘀活性成分防治机体老化性疾病研究提供一定参考。
【作者】孔松芝；
【导师】施旭光；
【作者基本信息】广州中医药大学，中药学，2014，博士
【关键词】羟基红花黄色素A；活血化瘀；抗氧化；阿尔茨海默病；皮肤光老化；

【参考文献】
[1]杨溪.高校网络教学平台的设计与实现[D].山东大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[2]胡娃萍.高传热性有机相变材料的制备与性能研究[D].武汉理工大学,2012.
[3]杨志高.电锤冲击系统波动力学建模与分析[D].湖南科技大学,机械工程,2013,硕士.
[4]柴大林.李鸿章对近代海军的认知及其知识构成述论[D].宁波大学,中国近现代史,2013,硕士.
[5]郝晓飞.中国《涉外民事关系法律适用法》中合同法律适用原则研究[D].哈尔滨工业大学,国际法学,2013,硕士.
[6]亓玢.区域医疗卫生信息化建设对改善社会医疗卫生服务的作用研究[D].山东大学,公共管理（专业学位）,2012,硕士.
[7]刘国艳.家庭财务管理系统设计与实现[D].山东大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[8]张琪.基于Vague集的电子商务信息安全评估模型和方法的研究[D].云南财经大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[9]睢丽颖.浅析《德伯家的苔丝》中的文化意象翻译[D].上海外国语大学,英语语言文学,2012,硕士.
[10]廖建军.基于计算机视觉的石材轮廓提取及缺陷检测[D].沈阳建筑大学,车辆工程,2013,硕士.
[11]杨新武,刘椿年.遗传归纳逻辑程序设计中规则的位串表示法[J].北京工业大学学报,2001,03:297-302.
[12]江翠华.经皮穿刺半月神经节靶向射频治疗三叉神经痛（Ⅲ支）的临床研究[D].南昌大学,麻醉学（专业学位）,2014,硕士.
[13]卢冬艳.中澳FTA对两国农产品贸易的影响研究[D].厦门大学,世界经济,2014,硕士.
[14]夏文荣.上海市计划生育药具公共服务研究[D].吉林大学,社会医学和卫生事业管理学,2014,硕士.
[15]韩晶晶.陕西省本科高校体育网站信息传播的现状与对策研究[D].西安体育学院,体育人文社会学,2013,硕士.
[16]娄佳欣.我国民事诉讼中证人书面证言研究[D].湘潭大学,诉讼法学,2012,硕士.
[17]段琳琳.通信系统中基于概率图模型的迭代接收技术研究[D].郑州大学,通信与信息系统,2014,博士.
[18]李梦巧.Banach空间的Hypercyclic子空间和Supercyclic子空间[D].重庆大学,应用数学,2014,硕士.
[19]程鑫.全自动轮对压装机位置检测与控制系统的研究[D].武汉理工大学,机械工程,2012,硕士.
[20]常照辉.初中英语教师反馈语和课堂互动质量的相关研究[D].沈阳师范大学,课程与教学论,2014,硕士.
[21]黄鹏.基于安全生产绩效的煤矿企业安全文化研究[D].辽宁工程技术大学,企业管理,2012,硕士.
[22]田丹.唐人小说中变形故事之研究[D].西北大学,中国古代文学,2013,硕士.
[23]温景容,武穆清,宿景芳.信息物理融合系统[J].自动化学报,2012,04:507-517.
[24]李丹.客户资产管理及度量[D].对外经济贸易大学,国际贸易,2004,硕士.
[25]薛安成,胡伟,梅生伟,倪以信,吴复立.电力系统动态安全域线性近似方法比较[J].电力系统自动化,2006,05:9-13.
[26]徐颖.真实活动盈余管理对企业绩效的影响研究[D].东北农业大学,会计学,2013,硕士.
[27]周连方.低功耗FIR滤波器设计关键技术[D].宁波大学,集成电路工程（专业学位）,2014,硕士.
[28]陈卫.航空运输业演化研究[D].北京交通大学,2012.
[29]苑润浩.病态方程组的RA加速投影法及新型SSOR预处理迭代法研究[D].燕山大学,概率论与数理统计,2013,硕士.
[30]洪悦.汽车广告对中国汽车消费文化的影响[D].东北师范大学,新闻学,2012,硕士.
[31]陈煜.腹腔筋膜室综合征家兔模型的优化及对机体的影响机制初探[D].南方医科大学,病理生理学,2012,硕士.
[32]刘会君,陈爽,王鹏,陆璐,潘再法,王丽丽.莪术药材的闪蒸气相色谱测定及其模式识别分析研究[J].化学学报,2012,01:78-82.
[33]陈江伟.网络企业盈利模式研究[D].河北经贸大学,企业管理,2012,硕士.
[34]彭湘郴.完善基层公务员激励机制研究[D].华中师范大学,公共管理,2014,硕士.
[35]李德彪.技工学校校园文化建设研究[D].厦门大学,工商管理,2014,硕士.
[36]单云冲.THz光栅结构UV-LIGA光刻工艺研究[D].合肥工业大学,仪器科学与技术,2014,硕士.
[37]刘立文.东辽河流域土壤侵蚀与景观格局时空关系研究[D].吉林大学,地图学与地理信息系统,2013,硕士.
[38]刘娟.基于D-A及D-A-D结构有机太阳能电池材料的密度泛函研究[D].西南大学,物理化学,2014,硕士.
[39]王兆博.格列本脲原料药生产线产能提升研究[D].天津大学,工商管理,2013,硕士.
[40]王从彦.全球变化背景下森林凋落物分解的驱动动力学研究[D].南京大学,生物学,2011,博士.
[41]周天睿,康重庆,徐乾耀,陈启鑫.电力系统碳排放流分析理论初探[J].电力系统自动化,2012,07:38-43+85.
[42]雷涵琳.多元智能理论对小学教育的启示[D].华中师范大学,小学教育,2014,硕士.
[43]韩梅兰.论旅游可持续性发展与汾河二库旅游的前景规划[D].中国农业大学,种植业,2004,硕士.
[44]叶圣展.科技文献句法结构翻译策略[D].黑龙江大学,翻译,2013,硕士.
[45]田录梅.自尊的认知加工偏好及其对情感反应的影响[D].东北师范大学,2007.
[46]姜川.天津市城乡居民基本医疗保险存在问题与对策研究[D].中国地质大学（北京）,公共管理,2013,硕士.
[47]李承宗.河北省审定玉米杂交种和亲本SSR指纹图谱的构建[D].中国农业科学院,作物（专业学位）,2012,硕士.
[48]何加.光网络生存性技术的理论研究和仿真分析[D].杭州电子科技大学,通信与信息系统,2012,硕士.
[49]李斌,姚斌,范瑞卿,李永丽.接地距离继电器的误动分析及改进[J].电力系统自动化,2010,18:95-99.
[50]杨保国　刘爱华.吸引本科生早日走进实验室[N].中国教育报,2012-07-16006.