人丙型肝炎病毒NS4B对Scribble蛋白和Hippo途径的作用机制研究

【摘要】目的：人丙型肝炎病毒(HepatitisCvirus,HCV)感染已成为一个全球性的健康问题,通过蛋白结构软件对非结构蛋白4B(non-structuralprotein4B,NS4B)进行分析,发现其C末端可能存在一个工类PBM基序(PDZ-bindingmotif,PBM),类似于一些致病病毒蛋白,然而目前对NS4B中PBM区域的鉴定以及其与PDZ极性蛋白的作用影响未见报道。本课题拟研究NS4B与包括Scribble等PDZ极性蛋白相互作用的分子模式,重点研究两个蛋白之间的相互作用机制,以及研究二者的结合对Scribble等PDZ极性蛋白复合物包括表达、定位分布和信号途径的调节,研究它们的互作对NS4B的细胞转化功能的影响；另一方面研究NS4B对Hipoo途径的影响以及所引起的生物学变化。方法：第二章：用基因扩增和基因定点突变以及重组技术构建了一系列质粒,包括携带有FLAG和荧光EGFP标签的NS4B缺失PBM和NS4B中PBM关键位点突变的突变体质粒,含Scribble蛋白中完整PDZ区域和不同PDZ区域单体或组合的Myc-PDZ质粒；免疫共沉淀和免疫荧光技术检测在HepG2、HeLa和293细胞中的NS4B或PBM突变体或缺失体与Scribble或截短体的定位与结合情况；用WesternBlot检测NS4B和其PBM缺失突变、PBM定点突变,对细胞内PDZ极性蛋白Scribble、Lg12和Par3的表达水平和定位的影响；通过泛素化检测探索NS4B对PDZ蛋白表达水平影响的可能机制；软琼脂克隆实验证明NS4B的PBM在NS4B对肿瘤细胞转化中的作用。第三章：WesternBlot检测NS4B对Hippo途径中关键激酶蛋白表达和活性的影响,检测Hippo途径和AKT途径的内在相关性；通过油红0实验检测NS4B(?)Merlin蛋白对脂滴形成的影响；通过基因过表达和沉默技术探索NS4BMerlin蛋白对脂滴形成相关蛋白的影响。结果：第二章：NS4B(?)Scribble相关质粒构建完成；免疫共沉淀和免疫荧光结果显示HCVNS4B的C末端存在的PBM能够与Scribble结合,而PBM缺失的和突变体则不能和Scribble结合,Scribble的PDZ、PDZ1-3和2-4结构域能够和NS4B结合；NS4B能够引起Scribble的表达减少,但对含PDZ结构域的极性Lg12和Par3蛋白的表达没有明显影响；此外,NS4B引起Scribble的泛素化水平增加,去泛素特异蛋白的表达水平下降；含PBM的比缺少和PBM突变的NS4B的软琼脂形成的克隆数显著增加。第三章：NS4B引起Hippo途径中的Merlin和AKT途径中关键激酶的表达或活性降低；油红0实验结果证实NS4B能够明显增高细胞内脂滴形成的数量；高表达Merlin蛋白后细胞内的脂滴形成数量减少,而沉默Merlin基因后脂滴形成数量增加；NS4B增加了细胞内SREBP1蛋白的水平,高表Merlin蛋白减少细胞内SREBP1蛋白的水平,沉默Merlin基因增加细胞内SREBP1蛋白水平。结论：NS4BC末端存在与PDZ极性蛋白相互作用的PBM区,NS4B与含PDZ结构域的细胞极性蛋白Scribble中的PDZ相互作用；NS4B通过增加Scribble的泛素化水平导致其降解,并影响Hippo信号途径中的关键蛋白的表达和磷酸化水平,从而影响细胞内脂滴形成。说明NS4B对病毒在宿主细胞的复制和致病性具有一定的帮助,为了解HCV的生物学和病理学特性提供了进一步的证据和方向。
【作者】张战锋；
【导师】黄宪章；
【作者基本信息】广州中医药大学，中西医结合基础，2014，博士
【关键词】丙型肝炎病毒；NS4B；Scribble；Merlin；泛素化；

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