肿瘤相关巨噬细胞M2型极化机制及其小分子化合物干预研究

【摘要】第一部分低氧对巨噬细胞M2型极化的选择性促进作用及其机制研究目的：巨噬细胞具有很强的功能可塑性,根据诱导条件的不同,巨噬细胞可以极化成两种主要的功能表型：经典活化的巨噬细胞(M1型)和替代性活化的巨噬细胞(M2型)。肿瘤组织中的巨噬细胞被称为肿瘤相关巨噬细胞(TAM),其表型和功能与肿瘤微环境密切相关。低氧作为众多恶性肿瘤发生发展过程中所必然经历的微环境条件之一,已被证实在TAM的浸润中发挥着重要作用,但其在TAM极化表型转换中的作用则鲜有研究。本部分研究将以低氧和巨噬细胞为研究对象,系统探讨低氧对巨噬细胞表型极化的影响和相关作用机制。方法：本研究采用小鼠巨噬细胞系RAW264.7和原代巨噬细胞BMDM作为研究对象。(1)流式细胞术检测RAW264.7细胞和BMDM细胞膜表面抗原的表达；(2)免疫组化及免疫荧光检测瘤组织切片相关蛋白的表达；(3)RT-PCR检测M2型巨噬细胞相关mRNA的水平；(4)表达谱芯片分析相关差异基因的表达；(5)Westernblot考察相关信号通路蛋白的表达。结果：首先,采用免疫荧光技术对Lewis肺癌细胞(LLC)移植瘤组织中M2型巨噬细胞的表达及分布进行检测,发现肿瘤中的巨噬细胞(F4/80+)大多表现为M2型(CD209+)且主要集中在低氧区域(PIMO+).这一结果提示,低氧可能对巨噬细胞的M2型极化有一定的调控作用。通过建立常压低氧动物模型,研究发现间歇性低氧处理C57BL/6小鼠能明显促进肿瘤组织中巨噬细胞的浸润,同时伴随着CD209+巨噬细胞比例的增加。进一步利用体外低氧共培养模型,研究发现低氧处理RAW264.7细胞能选择性地促进巨噬细胞极化因子(LLC-CM、IL6、IL4和IL13)诱导的M2型表面标记物CD209和CD206的表达,但对M1型表面标记物CD86的表达无明显影响。此外,RT-PCR结果显示低氧能显著增加IL6诱导的M2型特征性基因Arg1和Yml的mRNA水平。表达谱基因芯片结果显示低氧条件下IL6诱导的巨噬细胞表达高水平的M2型基因和低水平的M1型基因。在BMDM的原代巨噬细胞模型中,同样发现低氧能促进IL6诱导的CD209的表达。以上结果均表明,低氧能选择性地促进IL6诱导的巨噬细胞M2型极化。在机制研究方面,结合特异性抑制剂与分子生物学手段的应用,发现IL6/STAT3信号通路及低氧相关的HIF信号通路并不直接参与低氧对巨噬细胞M2型极化的选择性促进作用。进一步采用基因芯片技术分析不同诱导条件下获得的巨噬细胞的差异基因,结果发现多个差异基因在MAPK信号级联中富集。Westernblot结果也显示低氧能显著增加巨噬细胞中p-ERK,p-p38,p-JNK的表达。通过采用特异性抑制剂,证实虽然低氧条件下MAPK的三条子信号通路都被激活,但只有抑制ERK信号后才能逆转低氧介导的巨噬细胞M2型极化。结论：低氧微环境可以选择性地促进巨噬细胞M2型极化,该选择性促进作用与ERK信号通路的激活密切相关。第二部分低氧介导的M2型巨噬细胞对肿瘤转移的影响目的：低氧是包括非小细胞肺癌(NSCLC)在内的多数实体瘤发展过程中所必然经历的微环境条件。长期以来,肿瘤低氧研究的重心是其对肿瘤细胞本身的影响,而忽视了低氧通过作用于非肿瘤细胞来推动肿瘤发生发展的可能性。TAM作为非肿瘤细胞的主要成分,被认为是肿瘤恶性行为的参与者。第一部分的研究已经证实低氧能选择性地促进巨噬细胞的M2型极化(将该条件下获得的M2型巨噬细胞定义为低氧介导的M2型巨噬细胞)。在本部分研究中,将以NSCLC为研究对象,考察低氧介导的M2型巨噬细胞对肿瘤转移的影响,进而探讨低氧对巨噬细胞M2型极化的作用与低氧介导的肿瘤恶性行为(转移)之间的相关性,有助于从新的角度完善肿瘤低氧研究领域,以期为肿瘤治疗提供新的理论基础和可能的治疗策略。方法：(1)免疫组化及免疫荧光检测临床病人样本和瘤组织切片相关蛋白的表达；(2)划痕修复和transwell小室法检测细胞的迁移运动能力；(3)管腔形成实验考察HUVEC细胞的管腔形成能力；(4)C57BL/6动物模型检测Lewis肺癌的肺转移率；(5)SRB染色法评价肿瘤细胞的增殖能力。结果：36例人肺组织样本基因芯片数据(GSE1987)分析和55例(其中20例为转移病人)临床NSCLC病人样本的免疫组化分析结果表明M2型TAM与NSCLC的转移密切相关。在此基础上,通过体内外实验评价第一部分中阐述的低氧介导的M2型巨噬细胞对NSCLC转移的影响。体外实验,采用条件培养基与LLC细胞或HUVEC细胞共孵育模型,通过细胞增殖实验、划痕修复实验、transwell实验和管腔形成实验等手段,发现低氧介导的M2型RAW264.7细胞上清可增加HUVEC细胞的管腔形成和LLC细胞的迁移运动,但对LLC细胞的增殖无影响。体内实验发现,将低氧介导的M2型RAW264.7细胞与LLC细胞的共接种可增加LLC的肺转移发生率(从22.6%增加到100%)和移植瘤肿瘤组织中的血管生成。以上结果表明,低氧介导的M2型巨噬细胞具有强有力的促进肿瘤血管生成和转移的能力。鉴于低氧介导的M2型巨噬细胞表现出与低氧类似的促进肿瘤演进的功能,进一步考察低氧对巨噬细胞M2型极化的促进作用与低氧介导的肿瘤恶性行为之间的相关性。结果显示,间歇性低氧处理C57BL/6小鼠可显著促进LLC的肺转移发生率,从20%增加到60%。免疫荧光实验结果表明低氧处理后,肿瘤组织中的M2型巨噬细胞显著增加。此外,本研究还发现ERK特异性抑制剂PD98059可通过靶向巨噬细胞,(而不是肿瘤细胞)抑制肿瘤细胞的迁移运动。结论：低氧介导的M2型巨噬细胞,在体内外均能显著促进肿瘤的转移(迁移)和血管生成。干扰ERK可通过靶向巨噬细胞,抑制肿瘤细胞的迁移运动。第三部分基于抑制TAMM2型极化的化合物M的发现及其抗转移作用研究目的：抑制TAM的M2型极化被认为是极具应用前景的抗肿瘤转移新策略,但相关小分子化合物的发现尚处于起步阶段。因此,寻找并发现特异性抑制TAMM2型极化的小分子化合物是开发以TAM为中心的治疗策略的一个关键方向。前期研究中,通过筛选发现了特异性抑制巨噬细胞M2型极化的化合物M。在本部分研究中,将进一步评价化合物M对肿瘤转移的作用并初步探讨其作用机制,确证通过小分子化合物干预M2型极化实现抗肿瘤转移的可行性,以期为设计全新抗肿瘤转移化合物或干预手段提供思路及潜在靶点。方法：(1)SRB染色法评价细胞增殖能力；(2)流式细胞术检测RAW264.7细胞和BMDM细胞膜表面抗原的表达；(3)免疫荧光检测瘤组织切片中相关蛋白的表达；(4)RT-PCR检测M1、M2型巨噬细胞特征性mRNA水平；(5)Transwell小室法检测肿瘤细胞的迁移运动；(6)C57BL/6动物模型考察LLC的肺转移情况；(7)HE染色检测肺部转移灶点；(8)Westernblot考察相关信号通路蛋白的表达。结果：体外采用经典的IL13诱导的M2型巨噬细胞极化模型,从众多化合物中筛选得到可抑制巨噬细胞M2型极化的化合物M。在此基础之上,进一步应用IL4和IL6诱导的M2型极化模型,也得到了同样的结果。另一方面,通过对IFNy和LPS诱导的M1型巨噬细胞极化模型的考察,发现化合物M能选择性抑制巨噬细胞M2型极化,而对M1型极化无影响。LLC移植瘤组织切片的免疫荧光结果表明化合物M在体内也能抑制巨噬细胞的M2型极化。进一步考察化合物M的体外抗转移作用,研究发现化合物M可通过抑制巨噬细胞的M2型极化来影响肿瘤细胞的迁移运动。LLC自发肺转移动物实验结果显示化合物M具有体内抗肿瘤转移作用。通过引入巨噬细胞“清除剂”脂质体氯磷酸盐,研究发现化合物M对肿瘤肺转移的抑制作用可能是通过抑制肿瘤组织中巨噬细胞的M2型极化来发挥作用的。免疫荧光结果证实化合物M能减少移植瘤肿瘤组织中新生血管的形成。机制研究证实化合物M通过激活AMPK来发挥抑制巨噬细胞M2型极化的作用。结论：小分子化合物M能选择性地抑制巨噬细胞M2型极化,并基于此发挥体内外抗转移作用。化合物M对巨噬细胞M2型极化的选择性抑制作用依赖于AMPK信号通路的激活。
【作者】张俊；
【导师】杨波；何俏军；
【作者基本信息】浙江大学，药理学，2014，博士
【关键词】低氧；巨噬细胞；极化；非小细胞肺癌；转移；

【参考文献】
[1]吕鹏飞,唐功友,贾晓波,陶冶.非线性时滞系统次优控制的逐次逼近法[J].控制与决策,2004,02:230-234.
[2]吴智铭,张钟俊.控制系统计算机辅助设计技术综述[J].自动化学报,1984,02:182-191.
[3]徐敏.新农村公共服务社区化建设研究[D].浙江海洋学院,农村与区域发展（专业学位）,2014,硕士.
[4]乔梦怡,肖旭.经济增长中三大需求作用的实证分析[J].商,2014,07:195-196.
[5]陈钦.当今世界羽毛球竞技格局分析[D].湖南师范大学,运动训练学（专业学位）,2013,硕士.
[6]车小强.抗菌性牙科光固化复合树脂的制备及表征[D].兰州大学,口腔临床医学,2013,硕士.
[7]赵汝德.X市轨道交通X号线X站土建工程进度管理研究[D].西南交通大学,项目管理,2012,硕士.
[8]卢津强.通过改变浸润性提高固体表面抗结冰性能[D].浙江工业大学,2012.
[9]申耀楠.我国保险法上因果关系认定问题研究[D].吉林大学,民商法学,2014,硕士.
[10]魏国强.一类三次可积系统在三次扰动下的分支[D].福州大学,应用数学,2003,硕士.
[11]张皇.非圆齿轮数字化齿面接触分析[D].哈尔滨工业大学,控制科学与工程,2013,硕士.
[12]彭蔚兰.中学文言文教学困境思考及对策研究[D].福建师范大学,教育,2003,硕士.
[13]陈玲.市场化进程中的产业同构演化趋势分析[D].天津财经学院,统计学,2004,硕士.
[14]陈萌.WTO框架下国有企业补贴相关法律问题研究[D].山东大学,法律（专业学位）,2013,硕士.
[15]马莎莎.智力障碍儿童的社会适应能力研究[D].华东师范大学,特殊教育学,2013,硕士.
[16]张金国.生物化学课教学研究与实践[J].安阳大学学报.2002(03)
[17]高雁.新疆药用植物资源的开发与利用[D].新疆师范大学,植物学,2004,硕士.
[18]费佩.机构投资者持股对企业逃避税的影响[D].厦门大学,财政学,2014,硕士.
[19]徐高慧.一系列新型单萘基不对称卟啉与新型β，β’-键联卟啉—二氢卟吩二聚体的合成及表征[D].苏州大学,无机化学,2013,硕士.
[20]杨晓培.论经济犯罪的预防及其法律规制[D].江西财经大学,刑法,2013,硕士.
[21]董庆林.β-纤维蛋白原基因-455G/A多态性与缺血性中风的相关性研究[D].青岛大学,神经病学,2003,硕士.
[22]林剑波.不同形态类型鸡视网膜节细胞的中枢投射及其发育[D].中国农业大学,基础兽医学,2004,硕士.
[23]邓钗.清中期书画家董邦达、董诰父子书法研究[D].杭州师范大学,美术学,2007,硕士.
[24]朱凤义.社会弱势群体权利及其法律保护[D].吉林大学,法律,2004,硕士.
[25]徐梅华.骨髓来源间充质干细胞通过融合促进肺癌转移的实验研究[D].第三军医大学,内科学,2014,博士.
[26]刘玮晶.生物质炭对土壤中氮素养分滞留效应的影响[D].南京农业大学,环境工程,2012,硕士.
[27]谢艳梅.混合梁连续刚构桥结构几何参数优化研究[D].西南交通大学,桥梁与隧道工程,2013,硕士.
[28]白冰,张鹏远,闫瑜龙,秦禄盛,王明亮.内外边界施加温度荷载的中空圆柱试样热固结试验[J].岩土工程学报,2015,01:67-74.
[29]聂珍琳.IGF2基因组印迹介导结直肠癌的靶向治疗作用的实验研究[D].南京医科大学,临床检验诊断学,2013,硕士.
[30]杨玺,樊晓平.基于仿生小波变换和自适应阈值的语音增强方法[J].控制与决策,2006,09:1033-1036.
[31]郑海霞.心理距离和特质词效价对自发特质推理的影响[D].湖南师范大学,基础心理学,2014,硕士.
[32]李晶晶.财务信息透明度、公司治理对公司绩效影响研究[D].浙江理工大学,企业管理,2014,硕士.
[33]张向东,杨景华.基于ANSYS的公交车身静强度有限元分析[J].河北农机,2015,01:42-44.
[34]杜伟龙.基于ARM-Linux无线视频监控系统的设计与实现[D].辽宁石油化工大学,模式识别与智能系统,2014,硕士.
[35]王璐.逍遥宁心方加减治疗肝郁脾虚型心脏神经症的临床疗效观察[D].北京中医药大学,中医内科学,2014,硕士.
[36]宋玄.含铬污染物湿法解毒研究[D].中北大学,化学工程,2014,硕士.
[37]韩志勇,贺仁睦,马进,徐衍会,薄博.电力系统强迫功率振荡扰动源的对比分析[J].电力系统自动化,2009,03:16-19.
[38]谢立阳.基于海量数据挖掘的武汉城市圈应急物流系统的设计与优化[D].湖北工业大学,企业管理,2014,硕士.
[39]欧阳杰.高品质苎麻精干麻生产新技术及工艺研究[D].华中科技大学,生物化工,2013,硕士.
[40]刘鑫.论消费者知情权与商业秘密权的冲突与协调[D].贵州民族大学,法律,2014,硕士.
[41]唐振亚.重庆市露地大白菜氮素去向及投入阈值研究[D].西南大学,植物营养学,2013,硕士.
[42]蒋正龙.秸秆压块机的改进设计[D].合肥工业大学,机械电子工程,2013,硕士.
[43]赵显嵩.TC4钛合金高速切削的表面粗糙度与切削力实验研究[D].大连理工大学,机械制造及其自动化,2013,硕士.
[44]张斯尧.相干光OFDM系统中非线性损伤及其抑制方法研究[D].西南交通大学,通信与信息系统,2013,硕士.
[45]杨政.CRTSⅢ型板式轨道层间离缝下的受力及维修限值研究[D].西南交通大学,道路与铁道工程,2014,硕士.
[46]尹伊.“金砖国家”间清洁能源投资的问题研究[D].山西财经大学,国际贸易学,2014,硕士.
[47]见雪珍.填充聚四氟乙烯复合材料的力学性能和摩擦磨损性能研究[D].上海交通大学,2013.
[48]赵渊,黄旭,谢开贵.计及异步化同步发电机的电网可靠性评估模型[J].电力系统自动化,2011,19:6-11.
[49]杨国荣.图像处理中的演化方法[D].贵州民族大学,概率论与数理统计,2012,硕士.
[50]黄海凤,孔娴鹇,吴婷婷,卢晗锋.Cu-V-O氧化物催化燃烧甲苯的活性和抗硫性[J].燃料化学学报,2013,12:1525-1531.