微针介导的基于多重靶向于树突状细胞的抗肿瘤DNA疫苗纳米传递系统研究

【摘要】肿瘤免疫治疗是一种新的肿瘤治疗手段,在预防肿瘤复发、转移、治疗肿瘤病灶等方面有其独特的优势。DNA疫苗是很有发展前景的肿瘤治疗性疫苗,但常规的质粒DNA注射给药免疫效应不够理想,而且存在潜在的安全问题。研制具有强大免疫应答的DNA抗肿瘤疫苗给药系统与新型给药方法是药剂学研究人员面临的一个重大课题。为此,本研究针对现有DNA抗肿瘤疫苗转染率低,免疫性能不强等问题,利用树突状细胞膜表面的受体,设计两种新型的非病毒型纳米载体材料——甘露糖基化高分子PEI(PEI25k-Man)和甘露糖基化低分子PEI共价连接细胞穿膜肽CPP(CPP-PEI1800-Man).本研究以恶性程度高、目前各种治疗方法极不敏感的恶性黑色素瘤为抗肿瘤治疗模型,构建黑色素瘤特异肿瘤抗原(Trp2)、细胞因子(GM-CSF)、Fc融合蛋白3种基因表达单位元件,以构成一种多元、靶向、高效的复合型DNA疫苗为模型药物。进一步通过理化性能和生物学手段评价载体的细胞转染效率、体外靶向性以及对原代培养的树突状细胞(DC)的刺激、分化、成熟的实验研究,借助微针阵列技术考察这两种纳米载体材料介导DNA疫苗复合物的体内靶向性、小鼠抗黑色素瘤治疗及抗肿瘤预防免疫治疗效果。首先通过PEI结构中的伯氨与MPITC结构中的异氰酸酯一步缩合得到甘露糖基化的高分子聚乙烯亚胺(PEI25k-Man)和甘露糖基化的低分子聚乙烯亚胺(PEI1800-Man),再通过异型双功能交联剂SPDP分别与PEI18oo的伯氨和CPP的巯基进行反应,将两者结合在一起形合成CPP-PEI25k-Man。用IR和1H-NMR表征了所合成的两种阳离子聚合物载体材料。用MTT法考察了所合成的graft-PEI的细胞毒性,发现在相同作用时间、相同量的PEI及graft-PEI条件下,PEI25k-Man和CPP-PEI1800-Man对细胞的毒性均明显小于PEI25k的细胞毒性。通过PCR,成功扩增获得了黑色素瘤特异肿瘤抗原(Trp2)、GM-CSF和Fc目的基因片段,并将目的基因片段克隆到pUCm-T上,分别得到了Trp2-T质粒、GM-CSF-T质粒和Fc-T质粒。再从Trp2-T质粒、GM-CSF-T质粒和Fc-T质粒上分别进行BglⅡ、SaiⅠ双酶切和SaiⅠ、BamHI双酶切得到Trp2、GM-CSF、Fc基因,连接到pEGFP-N2载体上。由酶切鉴定和基因测序可知已成功构建了pEGFP-Trp2-GM-CSF-Fc多元质粒。对PEI25k-Man、CPP-PEI1800-Man分别进行理化性质考察,包括体外降解能力、缩合DNA能力、与DNA形成纳米复合物后的形态、粒径、电位及抗酶解和抗解离能力等性质。结果表明,graft-PEI/DNA纳米复合物的粒径大多都在80nm-250nm范围内,且各纳米复合物的粒径分布都比较窄(PDI<0.25),符合用于体内外转染实验的纳米复合物粒径范围；当N/P>10,graft-PEI/DNA纳米复合物的Zeta电位值都大于20mV,但与相同N/P的PEI25k/DNA纳米复合物的Zeta电位值都有所降低；通过TEM和AFM观察,graft-PEI/DNA纳米复合物均成类球形；凝胶电泳阻滞实验证明,一定的N/P值以上,graft-PEI阳离子聚合物均有压缩、包裹DNA的作用,并具有抗DNaseI酶和血清的作用。针对graft-PEI/DNA纳米复合物的对不同细胞毒性、细胞摄取、细胞转染,以阐明该两种阳离子聚合物作为基因载体的可行性,通过graft-PEI/DNA纳米复合物在不同细胞的摄取和转染实验以确定其体外对树突状细胞的靶向性；并对原代培养的人脐带血树突状细胞刺激、分化、成熟的实验研究。MTT结果显示,在DC2.4、B16、Hela三种细胞中graft-PEI/DNA纳米复合物的细胞毒性均明显低于PEI25k/DNA纳米复合物,特别是当N/P比大于10以后,各组细胞毒性都存在明显差异,其结果与单纯的聚合物细胞毒性结果相似。在该三种细胞中,相同N/P比例的graft-PEI/DNA复合物对DC2.4细胞毒性最大。通过共聚焦荧光显微镜及流式细胞仪检测,都证明graft-PEI/DNA纳米复合物在DC2.4细胞中的细胞摄取率明显高于PEI25k/DNA纳米复合物,且培养基中甘露糖的存在影响graft-PEI/DNA纳米复合物在DC2.4细胞摄取率,但PEI25k/DNA纳米复合物对此几乎无影响。通过共聚焦荧光显微镜观察到,纳米复合物转染DC2.4细胞48h后,细胞内绿荧光蛋白瞬时表达量是graft-PEI/DNA明显高于PEI25k/DNA纳米复合物。graft-PEI/DNA纳米复合物对DC2.4细胞和Hela细胞的摄取实验以及细胞转染实验的结果都证明graft-PEI/DNA纳米复合物具有体外DC靶向性。graft-PEI/DNA纳米复合物能刺激原代培养DC细胞表达表面共刺激因子。并使促使DC细胞分泌IFN-y和IL-12p70等细胞因子,与PEI25k/DNA组相比存在有显著性差异(P<0.01)。在微针作用下,graft-PEI纳米复合物在离体皮肤中的分布情况及体内靶向性研究。用激光共聚焦显微镜观察得到,微针作用于离体或在体皮肤,graft-PEI/DNA纳米复合物在皮肤活性表皮层的量明显大于PE125k纳米复合物。并且发现不同嫁接率的PEI25k介导QD在活性表皮层的量存在明显差异。在体外透皮扩散实验中,发现微针作用下,在预定时间内,纳米复合物无法透过皮肤层进入接受池中,且发现体外扩散后,graft-PEI/DNA纳米复合物在皮肤活性表皮层的量明显大于PEI25k纳米复合物。微针作用后48h,PEI25k-Man、CPP-PEI1800-Man组表皮层滞留量约为PEI25k增加2倍,在真皮层滞留量增加1.5倍。用流式细胞仪检测,在体小鼠微针给药后,graft-PEI/pEGFP-N2纳米复合物组的脾淋巴细胞中在CD11c阳性细胞中绿荧光蛋白表达量明显高于对照组PEI25k/pEGFP-N2,证明了graft-PEI/pEGFP-N2纳米复合物具有脾淋巴细胞靶向性。用活体荧光成像系统分析了graft-PEI/DNA纳米复合物在体内的淋巴靶向性。已构建的真核表达EGFP-Trp2-GM-CSF-Fc质粒与甘露糖基化修饰的graft-PEI/DNA形成纳米混悬液,作为肿瘤DNA疫苗,在微针的作用下对实验小鼠进行免疫接种,观察在小鼠体内诱导特异性免疫应答能力及抑制肿瘤效应。用ELISA检测免疫3次后小鼠脾淋巴细胞上清液IL-12、IFN-y的水平,发现PEI25k-Man/DNA和CPP-PEI1800-Man/DNA免疫组的淋巴细胞上清液中IFN-y浓度相对与裸DNA、PEI25k/DNA对照组水平明显提高。PEI25k-Man/DNA和CPP-PEI1800-Man/DNA免疫组的脾淋巴细胞上清液中IL-12与裸]DNA、PEI25k/DNA对照组相比,水平明显提高(P<0.01)。微针抗肿瘤预防免疫三次后,预先由PEI25k-Man/DNA和CPP-PEI1800-Man/DNA免疫过的小鼠肿瘤生长明显比PBS组缓慢,而PEI25k-Man/DNA免疫组小鼠肿瘤生长和CPP-PEI1800-Man/DNA免疫组没有明显差异。可见,PEI25k-Man/DNA和CPP-PEI1800-Man/DNA具有预防黑色素瘤生长的作用。这两组小鼠到100d后约90%还是成活的,而PBS组小鼠不到待接种肿瘤后50d内已全部死亡,PEI25k/DNA组到70d都死亡。微针抗肿瘤免疫治疗3次后,第7d,各组小鼠肿瘤体积无统计学差异,第14d及21d,PBS组肿瘤体积明显大于PEI25k-Man/DNA和CPP-PEI1800-Man/DNA组,PEI25k-Man/DNA和CPP-PEI1800-Man/DNA组小鼠肿瘤体积无统计学差异,第28d开始,PEI25k-Man/DNA和CPP-PEI1800-Man/DNA组小鼠肿瘤体积明显小于PBS组,且与PEI25k/DNA组小鼠肿瘤大小也具有统计学差异,说明PEI25k-Man和CPP-PEI1800-Man两种载体介导的EGFP-Trp2-GM-CSF-Fc质粒形成的纳米疫苗能够显著抑制黑色素瘤生长。且PEI25k-Man/DNA和CPP-PEI1800-Man/DNA两组小鼠到100d后约70%以上还成活的,而PBS组不到45d已全部死亡,PEI25k/DNA组到60d都死亡。肿瘤组织常规石蜡切片HE染色,显微镜下观察CPP-PEI1800-Man/DNA组和PEI25k-Man/DNA治疗组肿瘤坏死较明显,在瘤体周围和瘤体内有大量炎性细胞浸润,PEI25k/DNA组也可见部分肿瘤坏死和炎性细胞浸润,但明显要少于CPP-PEI1800-Man/DNA组和PEI25k-Man/DNA治疗组。PBS组在显微镜下几乎无肿瘤坏死和炎性细胞浸润。用免疫组化法检测CPP-PEI1800-Man/DNA和PEI25k-Man/DNA两组均有CD8+T淋巴细胞浸润,其中CPP-PEI1800-Man/DNA组最多,其次为PEI25k-Man/DNA组,PEI25k/DNA组出现少量呈棕褐色的细胞核,PBS组几乎未见CD8+T淋巴细胞浸润。综上所有研究结果,表明我们已经成功合成PEI25k-Man和CPP-PEI1800-Man两种阳离子聚合物载体材料,它们具有相对较低的细胞毒性。成功构建了包含有黑色素瘤特异肿瘤抗原(Trp2)、细胞因子(GM-CSF)、Fc融合蛋白3种基因表达单位元件pEGFP-Trp2-GM-CSF-Fc质粒。graft-PEI/DNA纳米复合物对树突状细胞的体外细胞靶向性；能刺激原代培养的人脐带血树突状细胞、分化、成熟,并分泌相关细胞因子。体内免疫预防及抗肿瘤治疗实验证明在微针介导下,graft-PEI/pEGFP-Trp2-GM-CSF-Fc纳米复合物对黑色素瘤的预防和抗肿瘤治疗具有很好的应用潜力。本文成功地设计了新型的多重靶向于树突状细胞的DNA疫苗纳米粒给药系统,探索了DNA疫苗接种新途径,为新型经皮疫苗给药系统的设计和安全使用提供依据。
【作者】胡英；
【导师】梁文权；
【作者基本信息】浙江大学，药物制剂，2014，博士
【关键词】纳米传递系统；微针；树突状细胞；DNA疫苗；透皮给药；多重靶向；肿瘤免疫治疗；

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