微囊化卵巢细胞的雌二醇和孕酮释放研究

【摘要】妇女的卵巢功能在进入更年期后逐渐衰退,雌二醇(E2)和孕酮(P4)分泌水平下降,导致更年期综合症。临床上常用激素替代疗法(HRT)来缓解患者的症状,但是,该疗法频繁地用药给患者带来了经济负担,长期的HRT治疗还可能引起严重的副作用。本文研究卵巢细胞的微囊化与异体移植后体内E2和P4的释放,主要包括四部分：(1)以海藻酸钠和壳聚糖为材料,使用静电液滴发生法制备海藻酸-壳聚糖-海藻酸(ACA)微囊。通过改变静电液滴发生装置的针头内径、电极距离、电压和注射流速,摸索控制海藻酸钙凝胶微球直径的方法；以微囊膨胀率(Sw)作为机械强度的评价指标,研究壳聚糖浓度和交联反应时间对ACA微囊机械强度的影响；比较不同壳聚糖浓度制备的ACA囊膜的牛血清白蛋白(BSA)和γ-球蛋白的透过性能。结果显示,使用较小的针头内径,缩短电极距离,提高电压和降低注射流速,可以制备直径较小的海藻酸钙凝胶微球；ACA微囊的Sw在10分钟内随交联反应时间延长而降低,之后不再发生显著变化；：1.2%(w/v)壳聚糖溶液制备的ACA微囊具有较高的机械强度和较弱的BSA渗透性能；0.6%和0.3%(w/v)壳聚糖溶液制备的ACA微囊的机械强度和BSA渗透性能均无显著差异；三种浓度壳聚糖溶液制备的ACA囊膜对Y-球蛋白的阻隔能力无显著差异。(2)以非洲爪蟾作动物模型,研究ACA微囊化卵巢细胞异体移植后的E2和P4分泌能力。用免疫组化法检测原代培养非洲爪蟾卵巢组织细胞的卵泡刺激素受体(FSHR)和黄体生成素受体(LHR)；用孕马血清激素(PMSG)处理原代培养细胞48小时,酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养液E2和P4浓度；用1.2%,0.6%和0.3%(w/v)壳聚糖溶液分别制备3组卵巢细胞ACA微囊,在培养28天内用CFDA-SE/PI处理并测算细胞成活率,检测培养60天内0.3%(w/v)壳聚糖组的培养液E2和P4浓度；将0.3%(w/v)壳聚糖溶液制备的卵巢细胞ACA微囊移植入去势雌性非洲爪蟾腹腔,ELISA法检测60天内血清的E2和P4水平。结果显示,原代非洲爪蟾卵巢细胞的FSHR和LHR免疫染色呈阳性,在20IU/mL的PMSG处理时,培养细胞的E2和P4分泌水平最高；制备ACA微囊的最适壳聚糖浓度为0.3%(w/v)；在体外培养条件下,ACA微囊化卵巢细胞保持60天的E2和P4分泌,并在移植后60天内显著提高了去势雌性非洲爪蟾血清E2和P4水平；移植后回收的微囊约90%保持完整和光滑。(3)大鼠卵泡颗粒细胞(GCs)和卵泡膜细胞(TCs)的共微囊化。用免疫组化法分别检测原代培养大鼠GCs和TCs的FSHR、LHR和CYP17A1;将GCs和TCs依不同数量比例混合并ACA微囊化,培养48小时后,检测培养液E2和P4浓度；将GCs和TCs数量比例为1：2的GCs/TCs微囊移植入去势雌性大鼠腹腔,检测60天内血清E2和P4水平。结果显示,GCs/TCs共微囊化显著提高了E2分泌水平,GCs/TCs数量比例为1：2时E2分泌水平最高,在移植后60天内将去势大鼠血清E2和P4维持在正常水平；移植后回收的微囊约90%保持完整和光滑。(4)建立模拟卵泡自然结构的卵巢细胞微囊化模式。微载体培养大鼠GCs(GCsMs),分别制备包有GCs、GCs+TCs、GCsMs和GCsMs+TCs的ACA微囊并体外培养,WST-1法检测微囊化GCs和GCsMs在培养24小时内的生理活性；培养48小时后,检测培养液E2和P4浓度；将模拟卵泡(GCsMs+TCs微囊)移植入去势雌性大鼠腹腔,检测60天内血清E2和P4水平。结果显示,微囊化GCsMs的生理活性显著高于微囊化GCs；与其它三种微囊相比,模拟卵泡的E2分泌水平最高,移植后60天内将去势大鼠血清E2和P4维持在正常水平；移植后回收的微囊约90%保持完整和光滑。综上所述,本文以海藻酸钠和壳聚糖为囊材,用静电液滴发生法制备了卵巢细胞的ACA微囊,并分别在非洲爪蟾和大鼠上进行了同种异体移植实验,发现非洲爪蟾卵巢细胞微囊、大鼠GCs/TCs微囊,以及模拟卵泡在体外培养条件下都具有雌性激素分泌功能,移植后60天内能够持续释放E2和P4,为妇女更年期综合症的治疗开拓了新思路。
【作者】刘聪；
【导师】刘龙孝；
【作者基本信息】浙江大学，药剂学，2014，博士
【关键词】细胞微囊化；颗粒细胞；膜细胞；微载体培养；雌二醇；孕酮；移植；

【参考文献】
[1]杨涛.气井井筒天然气流动规律及生产系统分析研究与应用[D].西南石油学院,2003.
[2]王兆平.气候正义下的国际碳排放权及其分配[J].江苏大学学报(社会科学版),2015,01:34-40.
[3]薛静.协作环境下基于WBS-FDSM-RAM的复杂产品项目进度控制研究[D].江苏科技大学,工业工程（专业学位）,2014,硕士.
[4]蒋雪梅.有序半导体纳米线阵列的制备及其性能研究[D].广东工业大学,2013.
[5]喻琼.论知悉内幕信息的认定[D].厦门大学,经济法学,2014,硕士.
[6]王成山,谢莹华,崔坤台.基于区域非序贯仿真的配电系统可靠性评估[J].电力系统自动化,2005,14:39-43.
[7]张真真.翻译这一行（第六章）翻译报告[D].四川外国语大学,翻译（专业学位）,2013,硕士.
[8]陈冲,杨萍.从社会距离的角度看校漂族的社会融入[J].中国青年研究,2012,04:51-54.
[9]王伟.政府监管视角下建筑产业竞争力问题研究[D].华侨大学,公共管理（专业学位）,2013,硕士.
[10]杨光.D大学教师绩效考核体系研究[D].燕山大学,工业工程,2014,硕士.
[11]程仁杰.基于博弈视角下我国民营企业良好政治关系的构建[D].湖北工业大学,政治学理论（专业学位）,2014,硕士.
[12]李仲生,蔡则苏,黄同成,赵乘麒.粒边缘模型及其实现[J].计算机工程与应用.
[13]杨双双.基于粗糙集的不完备序决策系统知识约简与规则提取的研究[D].青岛理工大学,计算机技术,2013,硕士.
[14]郑翔鸿.益气活血中药复方治疗急性脑出血随机对照试验的系统评价[D].成都中医药大学,临床急诊与危重病,2012,硕士.
[15]王小寒.从汉英旅游文本差异分析岳麓山景点介绍的英译[D].湖南师范大学,翻译（专业学位）,2013,硕士.
[16]李金良,陈锦江,王彦刚.机床主轴回转误差计算机辅助测试[J].一重技术.1995(01)
[17]姚伟文,王九华,程明熙,魏启东.江苏省电力发展与电煤供应[J].能源研究与利用.1989(04)
[18]杨帆.书籍封面的字体编排与设计研究[D].河北科技大学,设计艺术学,2012,硕士.
[19]刘明月.当代中国“草根明星”现象研究[D].山东师范大学,美学,2013,硕士.
[20]王丽虹.声乐教学中学生主观能动性的理论研究[D].湖南师范大学,音乐学,2004,硕士.
[21]李倩.济南南部典型河流氮素含量时空变化特征及影响因素分析[D].济南大学,水文学及水资源,2012,硕士.
[22]姚栋.基于多核的VPN测试系统设计与实现[D].西安电子科技大学,计算机技术,2011,硕士.
[23]叶文锦.技术创新与高技术产业国际竞争力的研究[D].浙江工业大学,2012.
[24]赵勇,张建平.福州地区负荷模型影响福建电网暂态稳定性的机理[J].电力系统自动化,2005,12:77-82.
[25]戴汝为.第七届国际模式识别会议在加拿大举行[J].自动化学报,1985,01:93.
[26]顾晓.中国人民银行的独立性研究[D].安徽大学,经济法学,2013,硕士.
[27]崔育忠.JSHB型同步电动机失步保护及自动再整步装置[J].冶金自动化,1980,05:34-43.
[28]王晓玉.甘肃银行会计运行模式设计研究[D].兰州大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[29]周雯庭.3’-叠氮-3’-脱氧-4’-螺环胸苷和2’，3’-双脱氧-4’-螺环胸苷的合成[D].吉林大学,有机化学,2014,硕士.
[30]季丽婷.格式塔心理学指导下的口译员心理工作模式研究[D].上海外国语大学,英语语言文学,2013,硕士.
[31]胡晓倩.脂解诱导的巨噬细胞聚集机制和海参皂苷对其调节作用的初步研究[D].中国海洋大学,食品科学,2014,博士.
[32]李英.配送中心物流实时追踪的研究与应用[D].北京交通大学,交通运输工程（专业学位）,2013,硕士.
[33]常晨阳.纳米荧光探针用于细胞内肿瘤标志物的同时测定[D].山东师范大学,2012.
[34]俞昌朝,储月霞,沈江南,阮慧敏,计伟荣.纳米碳管改性聚哌嗪酰胺复合纳滤膜的制备[J].高校化学工程学报,2014,01:84-91.
[35]张时雄.中部区域战略人力资源协同开发模式研究[D].安徽大学,企业管理,2014,硕士.
[36]王国清.6LoWPAN的研究及在WSN节点中的实现[D].北方工业大学,计算机应用技术,2014,硕士.
[37]石双宏.创业投资促进经济转型升级的实证研究[D].广东财经大学,金融学,2014,硕士.
[38]金小荣.基坑降水对周围环境影响的数值模拟分析[D].浙江大学,岩土工程,2004,硕士.
[39]程红军.我国部分师范类院校运动训练专业的现状及发展对策研究[D].北京体育大学,体育教育训练学,2013,硕士.
[40]张冬梅,李悦,沈熙环,周世良,张春晓.去劣疏伐对油松种子园交配系统及遗传多样性影响的研究[J].植物生态学报,2001,04:483-487.
[41]孙晴.氢酶碳纳米管分子聚集体材料的制备及其性能表征[D].复旦大学,2011.
[42]张传芳.基于CFD的多片湿式离合器摩擦片间流体特性研究[D].吉林大学,车辆工程,2014,硕士.
[43]张益波,张井岗,陈志梅.一种不确定离散时间系统的变结构控制方法[J].控制与决策,2002,S1:791-794.
[44]素里耶（SouliyaMOUNNARATH）.东盟预防性外交的发展及对老挝的影响[D].外交学院,外交学,2014,硕士.
[45]闫晓龙.《中国文学经典的翻译与传播》（第八章）翻译报告[D].四川外国语大学,翻译（专业学位）,2014,硕士.
[46]李红梅.石家庄市城乡居民收入差距分析[D].石家庄经济学院,人口、资源与环境经济学,2013,硕士.
[47]梁微波.血清可溶性髓系细胞触发受体-1在脓毒症中的临床应用价值[D].广州医科大学,内科学,2013,硕士.
[48]邵科.甜菜（Beta vulgaris L.）块根和含糖率增长与蔗糖代谢酶的关系及其营养调控的生理基础与实践[D].内蒙古农业大学,植物学,2014,博士.
[49]张春娜.供应链背景下中小企业违约风险研究[D].长安大学,物流工程与管理,2013,硕士.
[50]由志欣.西藏拟溞高密度培养的技术工艺优化研究[D].大连海洋大学,水生生物学,2014,硕士.