海洋生物毛蚶活性肽的研究

【摘要】海洋生物所具有的物种多样性构成了新药开发的巨大潜在资源。活性肽是海洋生物活性物质中的一类重要化合物。本论文研究了海洋生物毛蚶天然活性肽的分离纯化、指纹图谱、抗肿瘤活性与毛蚶酶解活性肽的分离纯化和抗肿瘤、抗氧化活性。本论文由两部分组成。第一部分利用正交设计实验,确定了毛蜡总蛋白提取物的最佳提取工艺为：加入两倍体积的磷酸盐缓冲液(pH8.0,10mmol/L)并匀浆3min。采用超滤分段和分级盐析方法,对总蛋白提取物进行分级分离。同时用MTT法测定各组分对八株肿瘤细胞(A549,BEL-7404,CNE,Hela,PC-3,HL-60,KB,P-388)的细胞毒活性,其中70～100%饱和度盐析组分对Hela.HL-60和KB的IC5o值分别为6μg/mL,24μg/mL和76μg/mL。通过对70～100%饱和度盐析组分进行指纹图谱的初步研究,确定了HPLC指纹图谱的条件为柱温30℃,检测波长280nm,流速1.0mL/min,流动相A为80%乙腈(含0.1%TFA),流动相B为0.1%TFA超纯水溶液,梯度洗脱,35min内,A相由50%线性升至70%,同时B相由50%线性降至30%；并对连续十批样品进行了指纹图谱分析。利用离子交换与凝胶过滤柱层析等方法,从70～100%饱和度盐析组分中纯化得到五个产物：G-2、G-3、G-4-2、G-6-1和G-6-2。体外抗肿瘤活性测定结果表明：G-4-2对Hela>HL-60和KB细胞的IC50值分别为22.9、g/mL、46.1μg/mL及57.7μg/mL,G-3对HL-60细胞的IC50值为123.2μg/mL,G-6-1对He1a细胞的IC50值为56.23μg/mL。SDS-PAGE实验证明,G-4-2、G-3、G-6-1、G-6-2和G-2均达到电泳纯。经RP-HPLC检测,G-3和G-4-2的纯度均大于96%。G-2、G-3、G-4-2、G-6-1和G-6-2的分子量分别为14,665.1Da、8,250.4Da、15,970.8Da、24,051.6Da及20,099.8Da；等电点分别为7.0、6.6、6.1、5.6和5.3。此外,尚测定了G-3和G-4-2的氨基酸含量；由苯酚-硫酸法初步测定G-3和G-6-2为糖肽类物质。论文第二部分通过正交设计试验,以水解度(DH)为依据,研究了中性蛋白酶、碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶对毛蚶的最佳酶解工艺。根据三种蛋白酶的最佳条件对海洋生物毛蚶进行酶解,发现碱性蛋白酶的水解度始终高于其它两种蛋白酶。凝胶过滤层析结果表明：木瓜蛋白酶酶解得到的肽组分大多分布在分子量较大的部分,碱性蛋白酶酶解产物中低分子量肽含量较多。采用离子色谱法进行氨基酸分析发现三种酶解产物肽含量顺序为：碱性蛋白酶水解产物>木瓜蛋白酶水解产物>中性蛋白酶水解产物。上述结果显示：碱性蛋白酶对毛蚶蛋白的酶解效果较好。研究蛋白酶酶解产物的抗氧化活性发现,三种酶解产物对DPPH自由基和H2O2的清除作用及还原力均呈量效关系,其中碱性蛋白酶水解产物对DPPH自由基和H2O2的清除作用最佳；三种酶解产物的还原力相似。根据蛋白酶的酶解效果和抗氧化活性研究结果,确定碱性蛋白酶为制备毛蚶抗氧化活性肽的最适蛋白酶。通过CMSepharoseFF离子交换层析分离得到三个组分：A-A、A-B和A-C。其中组分A-B对DPPH自由基清除效果最好,浓度为5mg/mL时清除率为67.64%。用SephadexG-25柱分离该组分,得到11个洗脱峰,其中g峰(A-Bg)和h(A-Bh)峰的清除率为32.89%(2mg/mL)和28.08%(2mg/mL)。RP-HPLCC8柱层析结果表明,h峰为纯品；g峰可进一步分得两峰,其中首峰A-Bgl的清除率强于A-Bg2。经过质谱分析和氨基酸N端测序,确定A-Bg1氨基酸序列为FCCC,A-Bh为WWW。
【作者】宋丽艳；
【导师】赵昱；于荣敏；
【作者基本信息】浙江大学，药物化学，2010，博士
【关键词】毛蚶；生物活性肽；分离纯化；指纹图谱；酶解；抗肿瘤活性；抗氧化活性；

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