单链抗体融合人血清白蛋白的制备及对重症肌无力患者血清的抑制作用

【摘要】重症肌无力(myastheniagravis,MG)是累及神经肌肉接头处的某些成分而导致突触后膜信号传导障碍的一种自身免疫病,以反复出现的肌肉收缩无力,用力时恶化,休息后缓解为特征。在80%～85%的MG患者中,其主要的靶抗原是肌肉的乙酰胆碱受体(muscleacetylcholinereceptor,AChR)。单链抗体(single-chainfragmentvariable,scFv)是由免疫球蛋白的重链可变区(variableregionofheavychain,VH)和轻链可变区(variableregionoflightchain,VL)经一条柔软可弯曲的肽链连接而成。scFv完整的保留了抗原结合的能力,由于它没有抗体的Fc段,因此不能激活补体。然而,scFv小分子的生理特点决定了它可以从体内经肾脏快速清除。scFv637是MG抗原特异性scFv,由人AChRa亚单位上67～76位氨基酸(即主要免疫原区,mainimmunogenicregion,MIR)组成。它可以结合MG患者血清中的抗MIR的自身抗体,从而保护人AChR,这使它有可能成为一种MG特异性免疫抑制治疗剂。与scFv一样,scFv637具有快速从血液中清除的缺点。因此,在本项研究中,我们将scFv637基因与半寿期较长的人血浆白蛋白(humanserumalbumin,HSA)基因连接,以延长scFv637的半寿期,增加其在血中的稳定性。这使得scFv有可能成为MG的一种特异性免疫抑制剂。目的：制备单链抗体融合人血清白蛋白,以延长单链抗体的半寿期并增加其在血中的稳定性,为重症肌无力的免疫治疗奠定基础。方法：将scFv637与HSA基因连接后转入毕赤酵母菌(Pichiapastoris)中表达出融合蛋白scFv637-HSA。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹试验确定其分子量；通过免疫荧光试验检测融合蛋白scFv637-HSA与人肋间肌AChR的结合情况；经竞争性ELISA检测融合蛋白抑制MG患者血清中的自身抗体与AChR的结合能力,以及融合蛋白在健康血清中的稳定性。结果：融合蛋白在毕赤酵母菌中成功表达,其分子量约为89kD；免疫荧光试验结果显示,融合蛋白可以与人肋间肌神经肌肉接头处的AChR结合；经12例MG患者血清检测发现,融合蛋白对AChR的抑制率为2%～77.4%；融合蛋白在静态健康血清中可以维持大约3天。结论：成功制备出scFv-HSA融合蛋白,并且其保留了保护AChR的能力。这使得scFv-HSA融合蛋白有望成为一种特异性免疫抑制治疗MG的手段。
【作者】李芳芳；
【导师】孟繁平；
【作者基本信息】延边大学，病理学与病理生理学，2014，博士
【关键词】重症肌无力；单链抗体；人血清白蛋白；融合蛋白；免疫抑制治疗；

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