GH促血小板生成机制分析及dTMP-GH对辐射损伤小鼠的救治作用研究

【摘要】随着电离辐射在军事、经济、农业生产、医疗卫生等领域中的不断应用，由电离辐射引起的各种损伤也在逐渐增加。骨髓是辐射敏感组织之一，当机体受到全身或局部一定剂量射线照射后，即可引起骨髓造血功能障碍，表现为白细胞、红细胞、血小板等全血细胞急剧减少，其中血小板生成减少和功能障碍是引起机体出血、感染的重要原因，也是影响机体存活和疾病预后的主要因素之一[1]。因此，促进外周血血小板水平的快速恢复是治疗辐射损伤的一个关键环节。目前临床上治疗血小板减少症的药物种类较少，而且大部分还存在着起效慢、副作用明显等缺点。所以，寻找和研制高效、低毒的新型升血小板药物成为一个人们迫切关注的问题。血小板来源于骨髓巨核细胞，而巨核细胞又是经造血干细胞分化而成，因此，巨核细胞的分化过程会直接影响血小板的产生时间和产量[2]。血小板生成素(thrombopoietin,TPO)是调节巨核细胞增殖、分化和血小板生成最重要的细胞因子。TPO与其受体c-Mpl结合后，激活相应信号通路，从而刺激巨核细胞的增殖、分化和血小板生成[3]。但是有文献报道，一些重度血小板减少症患者在使用重组人TPO（rhTPO）后5天左右时间外周血血小板水平才开始升高，到12天达到峰值，正因如此，患者处于血小板危象期的时间并没有得到显著缩短[4][5]。导致血小板延迟升高的原因可能与TPO不能促进巨核细胞终末分化（包括血小板前体形成和血小板释放）有关。更重要的是，由于能够诱导体内产生TPO中和性抗体[6][7]，美国FDA禁止了有关重组TPO基因工程药物的研发。基于此，人们转而寻找和研制TPO的类似物和模拟物。TPO模拟肽（thrombopoietinmimeticpeptide,TMP）的发现引起了人们的充分关注[1]，虽然它仅含14个氨基酸，但其二聚体或二联体多肽与TPO一样都可以结合并激活TPO的受体c-Mpl，显示出较强的促巨核细胞增殖与分化活性[2][3]。但是，无论是TMP二聚体还是二联体多肽的分子量都比较小，体内半衰期相对较短，使其体内应用受到限制。研究证实，生长激素(growthhormone,GH)通过与其受体GHR结合，能够促进不同种类细胞的增殖和/或分化[4]。有研究发现体内缺乏GH的DW/J侏儒小鼠外周血数量（包括有白细胞，红细胞以及血小板）显著降低[5]。随后有报道指出，给予放/化疗或骨髓移植小鼠大剂量的GH能够显著促进小鼠骨髓造血功能重建，包括血小板水平的快速恢复[6][7][8][9][10]。另外，近来一项临床研究结果表明，接受化疗药物强化治疗的血液肿瘤患者在使用大剂量GH后其外周血小板水平能提前3天左右时间恢复[11]。所有的这些数据都提示GH可能在血小板生成过程中发挥了重要的调控作用，但其具体作用于血小板生成的哪个阶段及相关机制尚不清楚。本研究首先分析了GH和一种血小板生成素模拟肽二联体(dTMP)分别对巨核细胞增殖分化、血小板前体形成以及血小板产生的调控作用及可能机制。研究发现dTMP主要作用于巨核细胞增殖分化的早期阶段，而GH则主要作用于巨核细胞的终末分化阶段，二者联合具有协调促血小板生成的作用。在此基础上，将GH与dTMP进行融合，通过体外实验对dTMP-GH融合蛋白的促血小板生成作用进行验证，进而探讨了dTMP-GH融合蛋白对辐射损伤所致小鼠血小板减少的救治作用。所取得的主要研究结果与结论如下：1.采用免疫磁珠分离、流式细胞分析、免疫荧光、电镜观察、Westernblot和CCK-8等方法，建立了人脐血来源巨核细胞原代培养、巨核细胞增殖分化、血小板前体形成和血小板产生等一套完整的血小板生成检测与分析技术体系。2.体外研究结果表明，GH不能促进巨核祖细胞的增殖，但具有促进巨核细胞分化的作用。3.GH能够以剂量依赖方式促进晚期巨核细胞形成血小板前体和产生血小板，提示GH具有促进巨核细胞终末分化的作用。4.对于早期巨核祖细胞，GH不能激活STAT5信号通路，但能延迟和持续激活ERK1/2信号通路，给予ERK1/2信号通路阻断剂能够抑制GH的促巨核细胞分化作用，提示GH的促巨核细胞分化作用与其激活ERK1/2的方式有关。5.对于晚期成熟巨核细胞，GH具有快速激活Akt信号通路的作用，并且能够增强Rho激酶Cdc42和Rac1的活性，给予Akt和Rho信号通路阻断剂可以抑制GH的促血小板前体形成和血小板生成作用，提示GH通过激活Akt/Rho信号通路而发挥促进巨核细胞终末分化的功能。6.体外实验证实dTMP能够以剂量依赖方式促进巨核祖细胞的增殖与分化，但对血小板前体形成和产板却具有抑制作用，说明dTMP主要通过促进早期巨核细胞的增殖与分化而发挥促血小板生成作用。7.与单独dTMP相比，dTMP与GH联合应用能显著促进血小板前体形成、加速血小板生成与释放，同时伴有β1-tubulin表达增强、巨核细胞内膜系统形成，提示GH与dTMP在血小板生成方面具有互补作用。8.dTMP-GH融合蛋白可以显著促进巨核细胞增殖与分化，且其作用显著优于单纯dTMP以及dTMP+GH处理组，提示通过与GH融合可以提高dTMP的促巨核细胞增殖分化能力，其机制可能与蛋白空间构象改变或受体介导信号通路的交叉激活有关。9.dTMP-GH融合蛋白能够显著上调巨核细胞GATA-1、NF-E2及β1-tubulin的表达；与单纯dTMP处理组相比，dTMP-GH融合蛋白处理组血小板前体形成和血小板产生时间提前，数量增多。10.Westernblot结果表明，dTMP-GH不仅能够快速激活巨核祖细胞中STAT5信号通路，而且还能持续活化ERK1/2信号通路，同时还具有激活晚期巨核细胞Akt的能力，从信号通路激活角度进一步证实dTMP-GH同时具有促进早期巨核细胞增殖分化和晚期巨核细胞成熟和产板的活性。11.成功复制急性辐射损伤小鼠血小板减少症动物模型，与生理盐水对照组和dTMP处理组相比，给予dTMP-GH融合蛋白处理能够加速受照小鼠血小板水平恢复，显著升高受照小鼠外周血小板最低值水平，缩短血小板处于低谷期时间，并显著提高小鼠存活率，提示dTMP-GH对急性辐射损伤所致血小板减少具有突出的救治作用。12.dTMP-GH融合蛋白对卡铂化疗及放疗联合化疗所致小鼠血小板减少也具有显著的救治作用，不仅可以促进血小板水平快速恢复，而且还可显著降低小鼠死亡率。总之，通过本实验研究我们首次发现GH具有促进巨核细胞终末分化、加速血小板前体形成和血小板产生的作用，并初步阐明了其作用机理；同时，发现GH与dTMP具有协同促血小板生成的作用，并证实dTMP-GH重组融合蛋白同时具有促进早期巨核细胞增殖、分化和晚期巨核细胞成熟和终末分化的活性，对辐射损伤和化疗所致血小板减少具有突出的救治作用，值得进一步研发。
【作者】许杨；
【导师】王军平；
【作者基本信息】第三军医大学，军事预防医学，2014，博士
【关键词】巨核细胞；生长激素；TPO模拟肽；血小板前体；血小板生成；融合蛋白；

【参考文献】
[1]王帅.时变条件下跨国供应链数量折扣和退货组合契约研究[D].西南交通大学,管理科学与工程,2013,硕士.
[2]何育民.水平振动式输送机的设计与研究[D].西安理工大学,机械设计及理论,2004,硕士.
[3]路宽.卫星地面站接收故障诊断系统的设计与实现[D].北京交通大学,软件工程（专业学位）,2013,硕士.
[4]郭媛媛.民国时期上海地区旗袍设计研究[D].淮北师范大学,美术学,2014,硕士.
[5]刘萌.人手与虚拟模型的交互技术应用研究[D].南京师范大学,教育技术学,2012,硕士.
[6]秦鸿儒.高速逆流色谱法分离砂地柏球果中有效组分的研究[D].浙江大学,物理化学,2013,硕士.
[7]王学斌.基于不同农产品价格形成机制的农产品定价权研究[D].内蒙古财经大学,企业管理,2012,硕士.
[8]李应林.CIK对人肺腺癌耐顺铂细胞A549/DDP杀伤效应及逆转耐药的初步研究[D].遵义医学院,内科学（专业学位）,2012,硕士.
[9]侯卫.机场刚性道面无损检测理论研究[D].西北工业大学,结构工程,2004,硕士.
[10]郭恩哲.二胡曲《赛马》及其音乐分析[D].内蒙古师范大学,音乐学,2012,硕士.
[11]张晶.朝阳市女性高级专业技术人才资源开发与管理研究[D].大连理工大学,公共管理（专业学位）,2013,硕士.
[12]黄晓燕.汉语高级阅读教学中任务型教学法的运用研究[D].曲阜师范大学,汉语国际教育（专业学位）,2013,硕士.
[13]胡彦辉.垂直深埋U型管大地耦合式地源热泵冬季实验研究与三维数值模拟[D].重庆大学,供热、供燃气、通风及空调工程,2003,硕士.
[14]丁志刚,胡钰林,周华良,夏雨,朱英英.一种新型变换器式取能电路[J].电力系统自动化,2013,12:109-113.
[15]李崇坚.交交变频正弦波型自控同步电机传动系统的分析[J].冶金自动化,1984,01:11-17.
[16]闫娟.政府、市场与公民社会三足鼎立中的有效政府[D].苏州大学,行政管理,2003,硕士.
[17]于雯雯.河北丰宁大西沟金矿金的赋存状态及矿床成因分析[D].中国地质大学（北京）,矿产普查与勘探,2013,硕士.
[18]杨建军.某购物中心工程质量管理研究[D].天津大学,工程管理,2013,硕士.
[19]陈国定,俞立.关联动态时滞系统的分散镇定[J].控制与决策,2000,01:92-94.
[20]林志栋,蒋子平.基于模糊灰关联分析的软件引入决策模型[J].控制与决策,2005,03:321-324.
[21]陈柯任.政治关联、市场化程度与民营上市企业成长性[D].重庆工商大学,会计学,2014,硕士.
[22]饶嵩.骨组织工程支架仿生设计与制造[D].武汉理工大学,机械电子工程,2004,硕士.
[23]汪洵.IMSX射线测厚系统在热轧带钢生产中的应用[J].冶金自动化,2003,S1:182-185.
[24]王峰.基于STEP/PDM模式的产品配置管理技术[D].浙江工业大学,2004.
[25]张鑫.PDGFR-β在人脑胶质瘤中的表达及临床意义[D].河北医科大学,外科学,2014,硕士.
[26]万海峰.骨关节炎相关Smad3突变基因的克隆及其初步的功能分析[D].中国人民解放军军事医学科学院,预防兽医学,2004,硕士.
[27]于耀光.锌镉基硫化物光催化剂的制备及制氢性能研究[D].哈尔滨工业大学,2014.
[28]肖珍教.上海地区高校本科生转专业的现状研究[D].华东师范大学,高等教育学,2004,硕士.
[29]张军华,仝兆岐,何潮观,关义贤.在f-k域实现三维波场道内插[J].石油地球物理勘探,2003,01:27-30+115-112.
[30]关驰.一类药物动力学系统的分析与控制[D].东北大学,运筹学与控制论,2009,硕士.
[31]周方勇.热处理对C、B与Y细化的BT20钛合金组织与性能的影响[D].哈尔滨工业大学,材料加工工程,2012,硕士.
[32]刘晓帆.龟甲、水蛭的品种与质量研究[D].北京中医药大学,中药生药学,2013,硕士.
[33]孙明丽.论无效合同的诉讼时效适用[D].苏州大学,民商法学,2013,硕士.
[34]段美涛.基于STDP规则的忆阻神经网络及应用[D].西南大学,信号与信息处理,2013,硕士.
[35]戚晨辉.轮轨接触参数化研究[D].华中科技大学,桥梁与隧道工程,2013,硕士.
[36]吴凯恩.针刺五輸穴补母泻子法结合中药治疗抑郁症的临床研究[D].广州中医药大学,针灸推拿学（专业学位）,2014,博士.
[37]金沈杰,吴绍春,吴耿锋,严胜祥.基于预聚类技术的并行序贯模式挖掘算法[J].计算机工程与科学,2004,10:66-68+90.
[38]刘祥志,娄坚鑫,郑清风,吴竞,刘方贵.变电站视频监控系统中行为识别功能设计与实现[J].电力系统自动化,2010,22:117-119.
[39]王征.张拉整体结构的找形和稳定性分析[D].西安电子科技大学,机械设计及理论,2012,硕士.
[40]荣键.基于不确定T-S模糊系统的可靠控制研究[D].沈阳师范大学,运筹学与控制论,2014,硕士.
[41]金党印.DHS与PFNA治疗股骨转子间骨折术后局部骨丢失的比较[D].山西医科大学,外科学（专业学位）,2013,硕士.
[42]麻金贺.轮毂在线识别系统的研究[D].燕山大学,机械工程,2014,硕士.
[43]王萍.本科毕业论文教学改革:机制、问题及优化路径——以政治与公共管理学院为例[J].高等农业教育,2012,01:31-35.
[44]胡瑞飞.面向机械工程计算机测试系统的数据挖掘技术研究[D].四川大学,2006.
[45]程旭.急性白血病患者端粒、端粒酶及其相关因素的研究[D].苏州大学,内科血液学,2003,硕士.
[46]吴菊英.日韩留学生转折连词习得偏误分析[D].苏州大学,汉语国际教育（专业学位）,2014,硕士.
[47]李国庆.时间序列分析在电力系统暂态稳定预测中的应用[J].控制与决策,1995,02:184-187.
[48]刘京杰,秦华.基于异常检测的网络预警系统结构研究[J].网络安全技术与应用,2005,11:30-32.
[49]廖先浩.智能小车弯道控制的研究与实现[D].重庆大学,控制工程（专业学位）,2014,硕士.
[50]李旭艳.对帮助犯与实行过限行为的案例分析[D].兰州大学,法律,2012,硕士.