BRAF基因突变与恶性肿瘤的系统评价及其痕量检测方法的构建

【摘要】肿瘤是威胁公众生命健康的重大疾病，在发达国家和发展中国家造成的死亡率分别位于首位和第二位。最新统计数据显示，2014年美国预计将有167万新生肿瘤患者，死亡人数将达到58万之多，位于前三位的分别是肺癌、结直肠癌、前列腺癌(女性为乳腺癌)。肿瘤形势如此严峻，不仅给世界各国的经济社会带来沉重的负担，而且给肿瘤全球防控带来严重的挑战。如何有效地控制肿瘤的患病率与死亡率已经成为卫生决策者、临床医生及相关研究者亟待解决的重大问题。研究发现肿瘤的发生、发展、诊治及预后与肿瘤基因位点的改变有着密切的关系，KRAS基因突变就是上述众多基因位点改变中的一种。目前，临床研究已经证明KRAS基因突变与单克隆抗体药物治疗肿瘤失败有着密切的关系，美国食品药品监督管理局(FoodandDrugAdministration，FDA)已经推荐将其作为单抗药物治疗肿瘤之前必做的一项检查。然而，少部分KRAS野生型的患者仍然会出现上述情况，究其原因主要是KRAS基因下游的核心分子BRAF基因突变促使丝裂原活化蛋白激酶（MitogenActivatedProteinKinase，MAPK）途径持续性激活导致的。目前，研究者已经在多种肿瘤中检测到了BRAF基因突变，而且对其结构及相关性质进行了深入的研究，取得了突破性的进展。与此同时，关于BRAF基因突变与临床常见恶性肿瘤病理特征之间关系的临床研究报道也越来越多，然而得到的结论差异性很大，存在的争议性问题较多。尽管如此，临床实践中仍然采用了一些方法对BRAF基因突变进行检测分析，以期为临床肿瘤患者的药物治疗提供一些参考。然而，目前的检测方法灵敏度普遍较低，检测BRAF基因痕量突变能力不足。高分辨率熔解曲线(highresolutionmeltingcurve,HRMA)是临床上灵敏度相对较高的一种方法，其灵敏度可以达到5%左右。目前，关于HRMA检测BRAF基因突变的临床研究报道逐年增多，但是研究中收集检测的样本量却均较小，检测的准确性难以评估，缺乏统计学说服力，而且尚未有研究通过统计学方法对其准确性进行过系统性地评价与分析。因此，HRMA能否用于临床BRAF基因痕量突变的检测分析还需要进一步的研究与探讨。近年来，分子生物学技术取得了突飞猛进的发展，针对BRAF基因突变检测的新技术也相继被研发出来。锁式PCR是上述新技术中检测低丰度突变更为有效的方法之一，其主要是使用了锁核酸探针用于提高碱基错配识别的能力，使检测的灵敏度更高，更适合痕量基因突变的检测分析。然而，目前这种方法仍然存在诸多问题，如：需要特异性的DNA聚合酶、对扩增的DNA质量要求高、突变鉴别采用凝胶电泳费时费力等，这些问题仍然需要进一步完善与改进。鉴于此，本课题拟首先采用可以解决研究结果不一致与增加统计学功效的系统评价与Meta分析的方法对BRAF基因突变与常见恶性肿瘤病理特征之间关系存在的争议问题进行解决，进一步明确检测BRAF基因突变的重要意义。在此基础上，对目前临床灵敏度较高的HRMA检测分析BRAF基因突变的准确性进行系统性地评估，了解是否有必要构建一种新的灵敏度更高的方法。如果目前HRMA灵敏度确实无法满足临床的需要，本研究则在锁式PCR的基础上进行改进与完善，构建一种基于LNA/DNA探针的高灵敏度方法用于结直肠肿瘤中BRAFV600E基因痕量突变的检测分析。目的：1、通过对BRAF基因突变与常见恶性肿瘤(结直肠肿瘤、肺癌)病理特征之间关系的系统评价及Meta分析，进一步明确检测BRAF基因突变的临床意义。2、通过对HRMA检测BRAF基因突变准确性的系统评价及Meta分析，了解构建高灵敏度BRAF基因痕量突变检测新方法的必要性。3、通过对锁式PCR方法的改进与完善，构建一种用于结直肠肿瘤BRAF基因痕量突变检测的高灵敏度方法，并用于临床标本进行验证分析。方法：1、通过检索PubMed、EmBase、SCI(科学引文索引)三大数据库，收集关于BRAF基因突变与常见恶性肿瘤病理特征关系及HRMA检测BRAF基因突变的相关文献资料；按照制定的纳入标准对文献资料进行筛选与纳入；然后对纳入文献资料进行质量评价、数据提取与合并及其他一些相关分析。2、设计与合成引物对及LNA/DNA嵌合体探针；对最佳引物对及其浓度、探针浓度、荧光染料浓度、退火温度等条件进行优化，确定BRAFV600E基因痕量突变检测的最佳反应体系及反应条件。3、评价新构建方法的灵敏度、特异性、重复性及准确性等指标，并用50例临床标本进行验证分析，评估其检测临床标本的能力。结果：1、BRAFV600E基因突变与结直肠肿瘤病理特征之间关系的系统评价纳入了25篇文献资料，涉及的病例数达到11955例，BRAFV600E基因突变率约为10.8%。研究结果表明，BRAFV600E基因突变与结直肠肿瘤患者的多项特征具有显著相关性：性别(OR=1.71;95%CI=1.42-2.07)、年龄(OR=2.29;95%CI=1.13-4.61)、TNM分期(OR=1.59;95%CI=1.16-2.17)、分化情况(OR=3.89;95%CI=2.94-5.17)、病理类型(OR=2.99;95%CI=2.20-4.07)、肿瘤位置(OR=4.85;95%CI=3.59-6.56)、MSI状态(OR=8.18;95%CI=5.08-13.17)、CIMP状态(OR=16.44;95%CI=6.72-40.21)、MLH1状态(OR=13.84;95%CI=1.75-109.24)。2、BRAF基因突变与肺癌病理特征之间关系的系统评价纳入了10篇文献资料，涉及的病例数达到5599例，BRAF基因突变率约为3.0%。研究结果表明，BRAF基因突变与肺癌病理类型具有显著相关性(OR=4.96;95%CI=2.29-10.75)。BRAFV600E基因突变与肺癌患者的两项特征具有显著相关性：性别(OR=0.27;95%CI=0.12-0.59)、吸烟(OR=0.14;95%CI=0.05-0.42)。3、HRMA检测BRAF基因突变准确性的系统评价纳入14篇文献资料，涉及的检测样本达到1324例。研究结果表明，敏感性为0.99(95%CI=0.96-1.00)、特异性为0.99(95%CI=0.99-1.00)、阳性似然比为68.01(95%CI=25.33-182.64)、阴性似然比为0.06(95%CI=0.03-0.11)、诊断比值比为1263.76(95%CI=393.91-4064.39)、SROC曲线的曲线下面积为0.995。4、完成了相关引物对及LNA/DNA嵌合体探针的设计与合成，确定了检测BRAFV600E基因突变的最佳反应体系：引物对为HQ-458/461，其浓度为0.2μM；退火温度为60℃；探针HQ-356浓度为0.5μM；EvaGreen染料为2×EvaGreen，循环数为50cycles。5、灵敏度检测结果显示可以达到0.01%，50临床样本的检测结果显示阳性率为16%(8/50)，明显高于传统PCR联合测序的方法(10%，5/50)。结论：1、结直肠肿瘤患者中BRAFV600E基因突变与性别、年龄、分期、分化、病理类型、位置、MSI、CIMP及MLH1等临床病理及分子病理特征之间具有显著的相关性。结果提示BRAFV600E与结直肠肿瘤的发生、发展、诊治及预后具有密切的关系，应该将其作为结直肠肿瘤预测与预后的一种标志物，用于结直肠肿瘤患者个体化药物治疗前的筛查。2、肺癌患者中BRAF基因突变与腺癌具有显著的相关性，BRAFV600E与女性及非吸烟者有一定的相关性。结果提示肺癌患者个体化用药前可以将BRAF基因突变与KRAS基因突变联合进行筛查，提高肿瘤个体化用药的准确性，筛查的主要对象是腺癌及女性患者。3、HRMA方法检测BRAF基因突变的准确性非常高，是目前临床检测BRAF突变较为理想的一种方法。但其不足之处是检测的灵敏度较低，只适合中晚期肿瘤患者标本的检测分析。4、构建的基于LNA/DNA探针的Real-TimeWTB-PCR检测方法能够有效地屏蔽野生型BRAF基因扩增，达到富集检测BRAF基因突变的目的，其选择性扩增能力强，灵敏度可以达到0.01%。5、构建的Real-TimeWTB-PCR检测方法的准确性高于常规PCR联合测序方法，完全可以用于结直肠肿瘤中BRAFV600E基因痕量突变的检测分析。而且本方法操作方便、闭管操作、成本低廉，如能在临床广泛使用将会为临床肿瘤患者个体化用药提供有价值的参考。
【作者】陈栋；
【导师】府伟灵；
【作者基本信息】第三军医大学，临床检验诊断学，2014，博士
【关键词】BRAF基因；痕量突变；结直肠肿瘤；肺癌；高分辨率熔解曲线；锁核酸；

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