TLR4信号负调控CD36表达影响脑出血血肿吸收及其机制

【摘要】脑出血(intracerebralhemorrhage,ICH)是一种常见的中风类型，虽经多年研究，但至今治疗手段有限。在动物实验及临床实践中发现，ICH后脑组织自身具有血肿吸收清除的能力，而且患者临床结局的好坏与血肿吸收速度的快慢呈明显正相关。因此促进内源性血肿吸收成为治疗ICH的新途径。ICH后血肿成分可导致小胶质细胞激活。在ICH早期，小胶质细胞可以通过吞噬红细胞及红细胞溶解成份来清除血肿。小胶质细胞发挥吞噬功能主要由清道夫受体CD36介导。CD36参与了小胶质细胞吞噬β-淀粉样蛋白、氧化低密度脂蛋白过程，并引起慢性无菌炎症，在阿尔茨海默氏病、动脉粥样硬化的发病中起作用。但CD36在ICH后的表达及其作用尚未阐明。越来越多的证据表明，炎症是ICH引起继发性脑损伤的关键因素。研究显示TLR4参与了无菌性炎症的发生发展，在中枢神经系统炎症反应中具有重要地位。已有研究显示TLR4信号激活产生的TNF-α等炎症因子可以下调巨噬细胞上的CD36的表达，进而影响巨噬细胞吞噬功能。但在ICH过程中，TLR4信号能否调控小胶质细胞的CD36表达，并进而影响吞噬功能尚不清楚。在本研究中，我们首先利用临床ICH病例，观察了CD36缺陷患者血肿吸收及神经功能恢复情况。在此基础上，利用在体和离体ICH模型，观察了CD36在ICH后表达变化规律及其在血肿吸收中的作用；然后我们观察了TLR4信号通路对CD36表达的调控及其对小胶质细胞吞噬功能的影响，探讨了ICH后CD36调控血肿吸收的相关机制。最后观察了TLR4抑制剂TAK242对CD36表达的调控及其对小胶质细胞吞噬作用的影响。第一部分CD36缺陷对脑出血患者血肿吸收及神经功能缺损的影响目的：观察CD36缺陷脑出血患者血肿吸收变化和相应神经功能恢复情况，以明确脑出血过程中CD36的功能。方法：收集199例脑出血患者一般临床及头颅CT资料，并对患者进行NIHHS评分和mRS评分。利用PCR-SSP技术和Westernblot技术对患者进行CD36缺陷筛查和分型鉴定，筛查出CD36Ⅰ型缺陷患者做为CD36缺陷组。同时挑选出具有和CD36缺陷组相同部位、相同出血量的CD36正常患者作为正常对照组。对比两组患者的脑出血后血肿吸收速度和相应神经功能评分。结果：我们共筛查18例CD36缺陷患者(9.0%)，其中11例为CD36I型缺陷(5.5%)。与对照组相比，CD36缺陷患者入院时临床基本资料、影像学特征、生化指标无显著差异，但经过相同治疗后，CD36缺陷患者血肿吸收速度显著减慢，NIHSS评分及mRS评分显著增高。结论：CD36缺陷患者血肿吸收减慢，神经功能缺损评分加重，提示CD36参与了血肿吸收，并与神经功能的恢复相关。第二部分，CD36在脑出血后脑组织中表达及其在血肿吸收中的作用目的：观察脑出血后脑细胞CD36表达及其变化；了解CD36缺陷后血肿吸收及小胶质细胞吞噬能力的变化，从而明确CD36在血肿吸收过程中的作用；方法：首先采用小鼠在体脑出血模型，利用Real-timeRT-PCR、WesternBlot观察脑出血后CD36表达的变化；其次利用免疫荧光化学等方法，观察人和小鼠脑出血后CD36主要在哪种脑细胞表达；再次利用离体脑出血模型，通过流式细胞仪、免疫荧光染色，观察CD36-/-小胶质细胞吞噬能力的变化，最后采用在体脑出血模型，观察CD36-/-小鼠血肿吸收和神经功能缺损等变化，以进一步证实CD36在脑出血血肿吸收中的作用。结果：与Sham组相比，脑出血组第1天CD36表达就有显著差异，到第3天达到高峰，到第7天CD36表达仍维持较高水平。CD36可以在神经元细胞、星型胶质细胞、小胶质细胞上表达，但以小胶质细胞表达为主。小胶质细胞可以直接吞噬红细胞，并且CD36-/-小胶质细胞或使用CD36抗体封闭的小胶质细胞吞噬红细胞的能力显著减弱。与野生型小鼠相比，CD36-/-鼠脑出血后血肿吸收显著减慢，神经功能恢复显著减慢，TNF-α、IL-1β表达显著增多。结论：1.CD36在脑出血后表达显著增高，在第3天达到最高峰，在第7天仍维持较高水平的表达，提示CD36参与了脑出血的病理过程。而且脑出血后，CD36主要在小胶质细胞表达。2.CD36-/-小胶质细胞对红细胞吞噬能力降低，使用CD36抗体封闭野生型小胶质细胞也得到类似结果，提示CD36在小胶质吞噬RBC过程中起十分重要作用。3.CD36-/-鼠脑出血后血肿吸收减慢，神经功能缺损加重，脑含水量增多，TNF-α/IL-1β等炎症因子分泌增多，提示CD36参与了血肿吸收，并与神经功能的预后相关。提示CD36可以作为治疗脑出血的一个新靶点。第三部分TLR4信号激活并负调控CD36表达影响脑出血血肿吸收及机制目的：观察TLR4-/-、MyD88-/-鼠脑出血后CD36表达变化，同时观察TLR4信号通路对血肿吸收和对小胶质细胞吞噬红细胞能力的影响，进而研究TLR4信号通路对CD36表达调控的机制。方法：使用在体脑出血模型，用Westernblot检测TLR4-/-、MyD88-/-鼠脑出血后CD36表达，并观察TLR4-/-、MyD88-/-鼠血肿吸收情况；使用离体脑出血模型，用流式细胞仪检测TLR4-/-、MyD88-/-小胶质细胞CD36表达和吞噬能力的变化；利用离体脑出血模型，用Westernblot和流式细胞仪观察炎症因子对小胶质细胞CD36表达和吞噬能力的影响。结果：与野生型小鼠相比，TLR4-/-、MyD88-/-鼠脑出血后CD36表达显著增高，血肿吸收显著增快。与野生型小胶质细胞相比，TLR4-/-、MyD88-/-小胶质细胞CD36表达显著增加，吞噬能力增强，而且这种作用可以被CD36抗体阻断。TLR4信号通路下游主要炎症因子TNF-α、IL-1β可以抑制小胶质细胞CD36表达，减弱其吞噬能力，TNF-α作用更加明显。结论：1.TLR4-/-、MyD88-/-鼠脑出血后CD36表达增高，血肿吸收增快，提示TLR4信号途径参与CD36表达的调控。2.在离体脑出血模型中,TLR4-/-、MyD88-/-小胶质细胞CD36表达增高，吞噬红细胞能力增强。而使用CD36抗体后，可以减弱该作用，进一步证实TLR4信号途径参与CD36表达的调控。3.在离体脑出血模型中，TLR4信号通路下游炎症因子TNF-α、IL-1β可以抑制小胶质细胞的CD36表达，并且可以削弱小胶质细胞的吞噬能力，其中以TNF-α为主，提示TLR4信号通路通过TNF-α、IL-1β负调控CD36的表达。第四部分TLR4抑制剂促进CD36表达，影响脑出血血肿吸收目的：观察TLR4抑制剂TAK242对小胶质细胞CD36表达和吞噬能力的影响，观察TAK242对神经元的保护作用及可能机制。观察TAK242对小鼠脑出血后血肿吸收的影响。方法：使用离体脑出血模型，用Westernblot和流式细胞仪检测TAK242对小胶质细胞CD36表达和吞噬能力的影响；利用神经元、小胶质细胞共培养技术，观察TAK242对神经元的保护作用；在离体脑出血模型中，用Real-timeRT-PCR检测TAK242对过氧化氢酶表达的影响，并测定过氧化氢浓度；同时使用在体脑出血模型，并观察TAK242对血肿吸收的影响。结果：在离体脑出血模型中，与对照组相比，TAK242增加了小胶质细胞CD36表达和吞噬能力，而炎症因子TNF-α、IL-1β可以减弱TAK242这一作用；在神经元、小胶质细胞共培养体系中，TAK242显著减少了神经元凋亡/坏死数量，并且增加了小胶质细胞的过氧化氢酶表达，减少过氧化氢分泌；在小鼠脑出血模型中，与对照组相比，TAK242可以促进脑出血血肿的吸收。结论：1.TAK242可以增强小胶质细胞CD36表达和吞噬红细胞能力，而TNF-α和IL-1β可以减弱TAK242作用，证明TAK242是通过抑制TLR4信号通路进而影响CD36表达。2.TAK242增加小胶质细胞的过氧化氢酶表达，减少过氧化氢分泌，对神经元细胞具有保护作用。3.TAK242不仅具有神经保护作用，而且促进了血肿的吸收，可能成为治疗脑出血的新药物。本研究在观察CD36在脑出血血肿吸收中作用的基础上，同时探讨了TLR4信号调控CD36表达,进而影响血肿吸收。进一步明确了脑出血血肿吸收的调控机制，也为通过促进血肿吸收治疗ICH这一全新理念提供实验依据，可望为ICH治疗提供新方法。
【作者】方煌；
【导师】杨清武；
【作者基本信息】第三军医大学，神经病学，2014，博士
【关键词】脑出血；血肿吸收；炎症；CD36；TLR4；

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