CD105靶向金磁纳米粒的合成及其对乳腺癌血管生成的MRI和CT实验研究

【摘要】目的：1．合成不同Au壳层厚度的金磁纳米粒Fe2O3@Au，研究Au壳层厚度对纳米粒磁化率和X射线吸收能力的影响，制备一种适用于磁共振成像（magneticresonanceimaging,MRI）和X射线计算机断层摄影（computedtomography,CT）的双模态对比剂；2．制备CD105靶向的分子探针Fe2O3@Au-PEG-CD105，探讨将它应用于MRI和CT成像评价乳腺癌血管生成的可行性。材料与方法：1．Fe2O3@Au纳米粒的合成及表征：在氮气保护下，以氯化铁和氯化亚铁为反应底物，采用化学共沉淀法合成Fe3O4纳米粒，在酸性条件下，将Fe3O4氧化生成Fe2O3。以Fe2O3为种子颗粒、氯金酸为还原底物、盐酸羟氨为还原剂，通过迭代还原法，将Au3+还原于Fe2O3表面，还原反应分5次进行，合成不同Au壳层厚度的Fe2O3@Au纳米粒。对合成的Fe2O3@Au纳米粒进行表征，包括电感耦合等离子体发射光谱仪定量各纳米粒的元素组成、透射电子显微镜检测纳米粒的形态和粒径、紫外-可见光分光光度计全波长扫描测量各纳米粒在400~800nm区间的吸收曲线、Zeta激光粒度仪测量各纳米粒的水力学直径和Zeta电位、振动样品磁强计检测各纳米粒的饱和磁化强度、MRI扫描检测系列浓度纳米粒溶液的磁化率、CT扫描测量系列浓度纳米粒溶液的X射线吸收能力。2．Fe2O3@Au纳米粒的表面修饰及稳定性分析：选择巯基聚乙二醇、巯基-聚乙二醇-羧基、巯基丙酸、谷胱甘肽，分别对Au还原次数为3的Fe2O3@Au纳米粒进行表面修饰，以分光光度计和Zeta激光粒度仪为检测手段，对比四种巯基化合物修饰的Fe2O3@Au纳米粒在pH值为5.0~9.0和盐浓度为0.01~0.10M溶液中的稳定性。3．Fe2O3@Au-PEG-CD105的合成及其细胞标记作用：利用修饰物HS-PEG-COOH本课题受国家自然科学基金（编号：81071197）和国家科技支撑计划项目子课题（编号：2012BAI23B08-4）资助提供的-COOH末端，将Fe2O3@Au纳米粒与抗CD105抗体的-NH2末端反应形成酰胺键，合成CD105靶向的分子探针Fe2O3@Au-PEG-CD105。以人脐静脉血管内皮细胞（humanumbilicalveinendothelialcells,HUVECs）为细胞模型，采用噻唑蓝法（MTT法）研究Fe2O3@Au-PEG-CD105的细胞毒性，普鲁士蓝铁染色和免疫标记技术研究该探针对HUVECs细胞的特异性标记作用，透射电镜观察它在HUVECs细胞内的代谢情况。4．Fe2O3@Au-PEG-CD105用于乳腺癌血管生成的MRI和CT靶向成像：将Fe2O3@Au-PEG-CD105与HUVECs细胞共培养，MRI和CT成像评价它的靶向标记作用和成像效果。将人乳腺癌MBA-MD-231细胞移植于裸鼠背部，建立裸鼠乳腺癌移植瘤模型，从裸鼠尾静脉引入Fe2O3@Au-PEG-CD105后，于不同时间点MRI和CT成像观察该探针的靶向标记和体内分布情况。扫描结束后，切除肿瘤行CD105免疫组织化学染色和普鲁士蓝铁染色，检测肿瘤MVD，分析感兴趣区信号强度与肿瘤MVD的相关性。结果：1．通过共沉淀法和迭代还原法制备了不同Au还原次数的Fe2O3@Au纳米粒，各纳米粒的平均粒径为36.5~56.5nm，全波长扫描下的吸收峰位于500~600nm区间，饱和磁化强度为42.4~59.6emu/g，在水溶液中均表现为正电位，多分散系数均大于0.1。对还原次数分别为1、3、5的Fe2O3@Au纳米粒的弛豫效能比较后发现，随着Au壳层厚度的增加，纳米粒的T2*弛豫效能由115mM-1S-1下降为61mM-1S-1；3种纳米粒金壳层的X射线吸收能力分别为碘的1.65、1.84和2.04倍。其中，Au还原次数为3的Fe2O3@Au纳米粒粒径为48.3nm，金壳层平均厚度为18.3nm，Fe2O3和Au的摩尔比为7.2︰26.8，该复合纳米粒呈超顺磁性，饱和磁化强度为49.0emu/g，T2*弛豫效能为95mM-1S-1，金壳层的X射线吸收能力是碘的1.84倍。结果显示Au还原次数为3的Fe2O3@Au纳米粒的各项指标较为均衡，既满足MRI增强成像所需的超顺磁性，也具备较强的X射线吸收能力，符合MRI和CT成像的基本需求。2．对Au还原次数为3的Fe2O3@Au纳米粒进行巯基聚乙二醇、巯基-聚乙二醇-羧基、巯基丙酸、谷胱甘肽表面修饰后，其Zeta电位从14.5mV分别下降为2.1mV、-19.3mV、-16.7mV、-22.8mV；水力学直径从55.2nm分别增大为84.9nm、85.2nm、65.9nm、70.3nm。在pH值为5.0~9.0以及盐浓度为0.01~0.10M溶液中，与巯基丙酸和谷胱甘肽相比，巯基聚乙二醇和巯基-聚乙二醇-羧基修饰的Fe2O3@Au纳米粒均保持较高的分散性和稳定性。3．利用巯基-聚乙二醇-羧基提供的-COOH末端，将纳米粒与抗CD105抗体通过酰胺化作用相结合，成功制备了CD105靶向的分子探针Fe2O3@Au-PEG-CD105。将人乳腺癌MDA-MB-231细胞与HUVECs细胞共培养，诱导HUVECs细胞向肿瘤性血管内皮细胞分化，流式细胞技术检测HUVECs细胞上CD105的表达率为86.84%。普鲁士蓝铁染色、免疫荧光标记和免疫细胞化学染色证明Fe2O3@Au-PEG-CD105对HUVECs细胞的标记是特异性的，并能被抗CD105抗体所阻断。透射电镜研究结果提示Fe2O3@Au-PEG-CD105可能通过受体介导的内吞方式进入HUVECs细胞。4．将Fe2O3@Au-PEG-CD105标记的HUVECs细胞用于MRI和CT成像，随着该探针浓度从0.1mM升高至1.0mM，各组细胞溶液的MRI信号强度逐渐降低，标记细胞的CT值有一定程度的增高，但在CT图像上表现不明显。采用裸鼠皮下注射人乳腺癌MDA-MB-231细胞的方式成功建立乳腺癌移植瘤模型。对移植瘤的扫描结果显示，Fe2O3@Au-PEG-CD105注射后，肿瘤感兴趣区的MRI信号强度随时间的延长呈“下降-上升-平台型”表现；肿瘤感兴趣区的CT值有所增强，其增强趋势与MRI信号强度的变化趋势相同。结合免疫组织化学和普鲁士蓝铁染色结果，证明Fe2O3@Au-PEG-CD105能与肿瘤新生血管靶向结合，感兴趣区MRI相对信号强度与肿瘤微血管密度正相关（P<0.05）。结论：本课题合成了不同Au壳层厚度的Fe2O3@Au纳米粒，对纳米粒的物质构成比进行优化，制备了一种可用于MRI和CT成像的双模态对比剂。基于Fe2O3@Au纳米粒合成了CD105靶向的分子探针Fe2O3@Au-PEG-CD105，由该探针介导，MRI和CT扫描能靶向检测乳腺癌的血管生成情况。通过本课题研究，有望为肿瘤新生血管的活体评价提供一条MRI和CT成像相结合的新思路。
【作者】张松；
【导师】邹利光；
【作者基本信息】第三军医大学，影像医学与核医学，2014，博士
【关键词】磁共振成像；计算机断层摄影；超顺磁性氧化铁；胶体金；乳腺癌；血管生成；CD105；

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