内质网应激诱导肝癌细胞化疗抵抗的机制及丹皮酚的逆转作用

【摘要】背景与目的：原发性肝癌是常见的消化道恶性肿瘤，其死亡率占恶性肿瘤死亡率的第三位。在我国肝癌发病率及死亡率均呈上升趋势，己严重威胁着人们的生命与健康。目前手术仍是治疗肝癌的首选方案，但多数患者就诊时已属中晚期，丧失了手术机会，此时化疗成为肝癌治疗的重要手段,但疗效很不理想。研究发现，内质网应激与肿瘤的关系甚为密切，是肝癌抗拒化疗药物的重要原因，因此研究内质网应激介导的化疗抵抗的原因和调控机制，进而通过特异性干预手段提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，对于提高治疗效果，延长患者生存期十分必要[19-21]。从天然产物中寻求高效、低毒的新型抗肝癌药物并深入探讨其抗肿瘤机制是当前国内外研究的重要课题。丹皮酚（Paeonol,Pae）又称牡丹酚，是我省道地中药材毛莨科植物牡丹PaeoniaSuffruicosaAndr根皮和萝摩科植物徐长卿PycnostelmaPaniculatum(Bunge)K.Schum干燥根或全草的主要有效成分，具有镇静催眠、解热镇痛、免疫调节及保护心脑血管等广泛的药理活性。我们在前期研究中发现，Pae对体内外的多种肿瘤细胞的增殖有较强的抑制作用，此外，我们也发现Pae能增强顺铂对人肝癌细胞HepG2、SMMC-7721和人食管癌细胞Eca-109、SEG-1的增殖抑制作用。但丹皮酚是否可逆转内质网应激介导的化疗抵抗中目前尚未报道，本研究首先探讨了内质网应激在介导肝癌细胞对化疗药物抵抗中的作用及机制，并观察了丹皮酚在逆转内质网应激介导的化疗抵抗的作用，同时探讨其可能的作用机制，以期为肝癌的临床治疗提供新的方法。目的：探讨内质网应激在肝癌细胞化疗抵抗中的机制及丹皮酚的逆转作用方法（1）采用MTT法观察TM诱导的内质网应激对阿霉素抑制HepG2肝癌细胞增殖的作用；采用流式细胞仪、TUNEL检测法观察TM诱导的内质网应激对阿霉素诱导HepG2肝癌细胞凋亡的影响。（2）Western-blot法观察TM诱导的内质网应激对HepG2肝癌细胞COX-2,GRP78表达的影响；MTT、流式细胞仪、TUNEL法观察COX-2选择性抑制剂塞来昔布在TM诱导的内质网应激状态下对阿霉素抑制肝癌细胞增殖及诱导肝癌细胞凋亡的影响；用Western-blot法观察COX-2选择性抑制剂塞来昔布和PI3K抑制剂LY294002对内质网应激诱导的HepG2肝癌细胞COX-2,p-AKT,CHOP表达的影响；（3）采用流式细胞仪、TUNEL法观察丹皮酚在TM诱导的内质网应激状态下对阿霉素诱导HepG2肝癌细胞凋亡的影响；用Western-blot法观察丹皮酚对内质网应激诱导的HepG2肝癌细胞COX-2,p-AKT,CHOP表达的影响。结果1.内质网应激在肝癌细胞对阿霉素敏感性中的作用（1）采用MTT法，观察衣霉素(Tunicamycin，TM)处理组、阿霉素处理组及TM预处理的阿霉素组对HepG2肝癌细胞的增殖抑制作用。与阿霉素处理组相比，TM预处理的阿霉素组的细胞增殖抑制率明显下降。（2）采用FCM和TUNEL法，观察对照组、TM处理组、阿霉素处理组及TM预处理的阿霉素组对HepG肝癌细胞的凋亡。与阿霉素处理组相比，TM预处理的阿霉素组的细胞凋亡率明显下降。提示内质网应激可诱导肝癌细胞对化疗药物产生抵抗。2.内质网应激诱导肝癌细胞对化疗抵抗的机制（1）用Western-blot法观察TM作用于HepG2肝癌细胞0h，4h，8h后GRP78，COX-2的表达情况。结果表明，使用TM作用HepG2肝癌细胞4h即可诱导GRP78表达的增多，提示内质网应激的产生，并且COX-2的表达随时间的延长逐渐增加。（2）采用MTT法，观察阿霉素处理组、TM预处理的阿霉素组及塞来昔布（50umol/L）+TM预处理的阿霉素组对HepG2肝癌细胞的增殖抑制作用。与阿霉素处理组相比，TM预处理的阿霉素组的细胞增殖抑制率明显下降；与TM预处理的阿霉素组相比，塞来昔布素+TM预处理的阿霉素组的细胞增殖抑制率明显升高。（3）采用FCM和TUNEL法，观察阿霉素处理组、TM预处理的阿霉素组及塞来昔布+TM预处理的阿霉素组对HepG2肝癌细胞凋亡的影响。与阿霉素处理组相比，TM预处理的阿霉素组的细胞凋亡率明显下降；与TM预处理的阿霉素组相比，塞来昔布+TM预处理的阿霉素组的细胞凋亡率明显提高。提示抑制COX-2可逆转内质网应激诱导的肝癌细胞对化疗药物的抵抗。（4）用Western-blot和QRT-PCR法从基因和蛋白水平观察COX-2选择性抑制剂塞来昔布对HepG2肝癌细胞内质网应激性凋亡蛋白CHOP的表达的影响，结果表明，使用COX-2选择性抑制剂塞来昔布可增加CHOP的表达，提示对CHOP的调控可能是内质网应激诱导COX-2产生化疗抵抗的重要原因（5）用Western-blot法观察COX-2选择性抑制剂塞来昔布对HepG2肝癌细胞PI3K/AKT表达的影响，结果表明，使用COX-2选择性抑制剂塞来昔布可在抑制COX-2表达的同时，抑制p-AKT的表达，同时用Western-blot法观察PI3K抑制剂LY294002对内质网应激诱导的HepG2肝癌细胞COX-2的表达的影响，结果表明，使用PI3K抑制剂LY294002对内质网应激诱导的COX-2的表达无影响，提示COX-2可调控PI3K/AKT通路的表达。进一步研究发现使用PI3K抑制剂LY294002也可在抑制肝癌细胞HepG2p-AKT的同时，肝癌细胞的CHOP表达增多，提示抑制COX-2/PI3K/AKT通路继而调控CHOP的表达可逆转内质网应激诱导的肝癌细胞对化疗药物的抵抗。3.丹皮酚在内质网应激诱导肝癌细胞对化疗药物抵抗中的作用（1）采用FCM和TUNEL法，观察阿霉素处理组、TM预处理的阿霉素组及丹皮酚（31.25mg/L）+TM预处理的阿霉素组对HepG2肝癌细胞的凋亡的影响。与阿霉素处理组相比，TM预处理的阿霉素组的凋亡率明显下降；与TM预处理的阿霉素组相比，丹皮酚（31.25mg/L）+TM预处理的阿霉素组的凋亡率明显提高。提示丹皮酚可逆转内质网应激诱导的肝癌细胞对化疗药物的抵抗。（2）用Western-blot法观察丹皮酚对内质网应激诱导的HepG2肝癌细胞COX-2，p-AKT，CHOP的表达的影响。结果表明，使用丹皮酚可抑制内质网应激诱导的HepG2肝癌细胞的COX-2的表达，同时，在丹皮酚抑制内质网应激诱导的COX-2的同时，HepG2肝癌细胞p-AKT的表达逐渐下降，并伴随HepG2肝癌细胞的CHOP表达增多，与COX-2选择性抑制剂塞来昔布和PI3K抑制剂LY294002作用内质网应激诱导的肝癌细胞CHOP的表达结果相似。提示丹皮酚可能通过COX-2/PI3K/AKT通路上调CHOP的表达逆转内质网应激诱导的肝癌细胞对化疗药物的抵抗。结论1.内质网应激可能通过COX-2/PI3K/AKT通路调控CHOP的表达介导肝癌细胞对化疗药物的抵抗。2.丹皮酚可能通过COX-2/PI3K/AKT通路调控CHOP的表达逆转内质网应激诱导的肝癌细胞对化疗药物的抵抗。
【作者】宋兵；
【导师】孙国平；
【作者基本信息】安徽医科大学，内科学，2014，博士
【关键词】肝细胞癌；COX-2CHOPPI3K/AKT；内质网应激；化疗抵抗；丹皮酚；

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