人参皂苷CK对实验性关节炎的治疗作用及其抗炎免疫调节机制

【摘要】前言类风湿关节炎（rheumatoidarthritis，RA）是一种自身免疫病。RA主要的病变位于关节滑膜，关节局部产生大量的细胞因子和趋化因子使滑膜炎症持续存在，滑膜增生，血管翳形成，侵蚀破坏软骨和骨组织，最终导致关节破坏和畸形。RA的发病机制仍未完全清楚，目前认为大量的活化的T细胞、B细胞、巨噬细胞和树突细胞（dentriticcells，DC），相互活化，分泌细胞因子，是诱导RA自身免疫反应发生，导致关节滑膜炎症的关键因素。由于RA的发病机制尚不清楚，目前还没有满意的治疗方法。临床上用于治疗RA的药物包括甾体抗炎药、非甾体抗炎药、疾病调修药、生物制剂以及天然药物等。近年来，具有抗炎和免疫调节活性的天然药物及其有效成分，已经成为治疗RA新药研发的热点。人参皂苷CK（GinsenosideCompoundK，CK），属于二醇型人参皂苷，为天然二醇型人参皂苷如人参皂苷Rb1、Rb2、Rc等在人肠道内的主要降解产物，是人参皂苷在体内吸收和发挥活性作用的主要形式。文献报道人参皂苷以及CK可抑制炎性细胞因子的分泌，提示CK具有一定的抗炎作用。然而CK对实验性关节炎是否具有治疗作用，以及抗炎免疫调节作用机制不清楚。本研究观察了CK对实验性关节炎的治疗作用，以及对免疫细胞（T细胞、B细胞、巨噬细胞和DC细胞）和成纤维样滑膜细胞（fibroblastsynoviocytes，FLS）的调节作用，明确CK对实验性关节炎的治疗作用，以及其发挥抗炎免疫调节作用的部分机制，为CK作为新型的治疗RA的药物提供实验依据。目的：观察CK对大鼠佐剂性关节炎（adjuvant-inducedarthritis,AA）的治疗作用，以及对免疫细胞（T细胞、B细胞、巨噬细胞和DC细胞）和滑膜细胞的调节作用，明确CK对实验性关节炎的治疗作用及其发挥抗炎免疫调节作用的部分机制，为CK作为新型的治疗RA的药物提供实验依据。方法：将10mg/ml弗氏完全佐剂（completeFreundadjuvant，CFA）充分混匀，于每只大鼠右后足跖皮内注射CFA0.1ml，制备大鼠AA模型。正常组用生理盐水同法注射。CK（5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg、160mg/kg）每天一次灌胃给药（intragastricadministration,ig）（d15～d29），观察大鼠全身关节炎评分，关节炎指数，足爪肿胀数及足爪肿胀度；检测脾脏和胸腺指数，光学显微镜观察踝关节和脾脏病理变化，并进行病理评分；3H-TdR检测T、B细胞和滑膜细胞增殖；流式细胞术检测脾脏T细胞亚群包括初始T细胞亚群（CD4+CD62L+）、活化T细胞（CD4+CD25+）和调节性T细胞（CD4+CD25+Foxp3+，Treg）；B细胞亚群包括记忆B细胞（CD45R+CD27+）和总B细胞（CD45R+IgM+）和T细胞上CD25的表达。ELISA检测细胞因子白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（Tumornecrosisfactor，TNF-α）、γ-干扰素（interferon-γ，IFN-γ）、IL-4、IL-17、IL-10、IL-2、核因子κB受体活化因子配体（ReceptorActivatorforNuclearFactor-κBLigand，RANKL）和骨保护素（osteoprotegerin，OPG）水平，以及血清IgG1、IgG2a、抗环瓜氨酸肽（cycliccirullinatedpeptide，CCP）抗体和抗II型胶原（CⅡ）抗体水平。DBA/1小鼠的尾根部皮内注射CII乳剂诱导胶原性关节炎（collageninducedarthritis，CIA）模型，流式细胞术检测淋巴结树突细胞（dedriticcells，DC）亚群包括单核细胞源性DC（monocyte-deriveddedriticcells，mo-DC）（CD11b+CD209+）、浆细胞样DC（plasmacytoiddendriticcells，pDC）（CD11c+PDCA-1+）和初始T细胞亚群（CD4+CD62L+），以及DC上CD80、CD86、MHCⅡ、CCR7的表达；ELISA检测淋巴结CCL21水平；transwell检测DC的迁移，混合淋巴细胞反应检测DC活化T细胞的能力。结果：1.CK可以减轻AA大鼠的关节炎症状，改善脾脏和关节病理，抑制滑膜细胞异常增殖和分泌。CK（10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg、160mg/kg）可以不同程度的减轻AA大鼠的关节炎症状，包括降低关节炎全身评分和关节炎指数，减少关节肿胀数和减轻关节肿胀度。随剂量增加CK的抗炎作用逐渐增强，当剂量增加到160mg/kg，其抗炎作用与80mg/kg相比无统计学差异，已基本达到最大效能。CK的对数剂量与其全身评分的抑制率有明显的线性关系（y=0.1606χ+0.1771，R2=0.8297，P=0.0116），CK的ED50值为102.5mg/kg。在抗炎作用起效时间方面，CK（80mg/kg、160mg/kg）d21开始起效，CK（40mg/kg）d24开始起效，CK（10mg/kg、20mg/kg）d30开始起效，随着剂量的增大，起效时间逐渐提前。CK（20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg、160mg/kg）可以降低脾脏指数，减轻AA大鼠的脾脏病理改变，包括降低动脉周围淋巴鞘和边缘区厚度、减轻淋巴小结增生和生发中心形成。CK（40mg/kg、80mg/kg、160mg/kg）可以改善AA大鼠的关节病理，包括抑制滑膜细胞增生和血管翳形成，减轻滑膜组织炎细胞浸润以及骨破坏。CK（40mg/kg、80mg/kg、160mg/kg）可以抑制滑膜细胞异常增殖，CK（1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L）体外给药显著恢复FLS分泌OPG，抑制RANKL的分泌。2.CK可以减少T、B细胞活化，恢复细胞因子平衡。CK（40mg/kg、80mg/kg、160mg/kg）可以降低AA大鼠脾脏中活化的T细胞的比例和记忆B细胞的比例，提高Treg和初始T细胞的比例，抑制T、B细胞的增殖。CK（10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg、160mg/kg）可以降低血清抗II型胶原抗体，CK可以降低（160mg/kg）IgG2a水平；对抗CCP抗体IgG1的水平没有影响。CK（40mg/kg、80mg/kg、160mg/kg）降低血清IL-1β水平，对血清IL-4水平没有影响。CK（20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg、160mg/kg）可以抑制巨噬细胞IFN-γ的分泌，CK（40mg/kg、80mg/kg、160mg/kg）可以抑制巨噬细胞IL-17的分泌，CK（80mg/kg、160mg/kg）可以抑制TNF-α的分泌，促进IL-10的分泌。体外研究发现CK（10-5M，10-6M，10-7M）可以抑制AA大鼠T细胞的活化，表现为抑制其表面CD25的表达以及IL-2的分泌。3.CK可抑制树突细胞成熟迁移和归巢，减少T细胞的活化。CK（56mg/kg、224mg/kg）可以减少CIA小鼠淋巴结mo-DC、pDC亚群的比例，增加初始T细胞比例，降低淋巴结CCL21水平。体外实验发现CK（10-7M，10-5M）可以抑制DC上CCR7的表达，抑制CCL21介导的DC的迁移；抑制DC的成熟，降低其表面共刺激分子CD80、CD86和MHCⅡ的表达，减弱DC活化T细胞的能力。结论：1．CK对大鼠AA有明确的治疗作用。2.CK可以调节免疫细胞功能，恢复细胞免疫和体液免疫平衡。3.CK抑制DC迁移归巢及T细胞活化是其发挥免疫调节作用的重要机制之一。
【作者】陈镜宇；
【导师】魏伟；
【作者基本信息】安徽医科大学，药理学，2014，博士
【关键词】人参皂苷CK；实验性关节炎；T细胞；B细胞；巨噬细胞；树突细胞；滑膜细胞；免疫调节；

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