淮阴苜蓿耐热的蛋白质组学研究

【摘要】高温是植物生长的主要限制因子之一。世界气象组织(IPCC)报告在21世纪末温度可能增长1.4到5.8℃。在温带地区,极端的高温气候将出现的更加频繁。温度的升高对世界范围内的作物产量会造成严重的危害。淮阴苜蓿(MedicagosativaL.cv.HuaiYin)是我国唯一一个生长在江淮地区的苜蓿类型,具有极耐高温、高湿特性,是我国宝贵的苜蓿品种之一。研究高温胁迫下淮阴苜蓿蛋白质组的变化,将对植物在高温胁迫下的应答机制有一个更加深入的了解,并为植物耐热相关新品种的选育提供方向。研究首先利用形态学标记和SSR标记鉴定了淮阴苜蓿的种质特性及种内遗传变异。在成功建立一个双向电泳体系的基础上,研究了淮阴苜蓿对不同高温胁迫的生理和蛋白响应。并进一步对40℃不同处理时间淮阴苜蓿蛋白质组进行双向电泳分离,运用PDQuest8.0.1软件分析差异蛋白点,并通过质谱技术和Mascot工具对分析获得差异蛋白点进行鉴定,在蛋白质组学的角度探讨了高温下淮阴苜蓿的响应和可能机制。1、淮阴苜蓿种质特性及种内变异的分析研究通过形态学标记和SSR标记,分析了淮阴苜蓿的种质特性及种内变异。结果表明,淮阴苜蓿具有开花早,生育期短的特性,整个生育期约为249天。秋眠级1.7158,是个极秋眠品种。淮阴苜蓿初花期株高61.8-136.2cm；分枝数9-80个；主茎节间数13-23个；叶长2.5-4.4cm；叶宽0.8-2.49cm；主茎倾斜角度8.26-58.4°,趋于直立,淮阴苜蓿各形态特性的平均变异系数为24.2%。对淮阴苜蓿SSR的分析表明,淮阴苜蓿基因多样性指数为25.32%。聚类分析结果表明,淮阴苜蓿单株间平均遗传距离为10.26,相似系数平均为0.8。与其它苜蓿品种相比,淮阴苜蓿遗传多样性水平较低,大多数单株表现出相似的形态特征。淮阴苜蓿较高的一致性可能与生长的地理环境有关。淮阴苜蓿种内变异的分析也为苜蓿蛋白质组研究的取样提供依据。2、适用于苜蓿叶片的双向电泳技术以蒺藜苜蓿叶片为研究材料,对TCA-丙酮蛋白提取法、聚焦和凝胶染色方法等进行一系列优化。研究发现,采用改进的TCA-丙酮法提取总蛋白,17cmpH3-10的固定化梯度胶条聚焦123,000伏时,12%的SDS-PAGE进行垂直电泳,胶体考染法染色可以获得最佳的实验结果。研究认为,改进的TCA-丙酮法能更好的去除样品中的杂质,获得更好的聚焦效果。同时也发现,2-DE的聚焦效果与聚焦伏时和蛋白上样量相关,更大的蛋白上样量需要更长的聚焦时间才能使蛋白更好的聚焦,获得清晰的2-DE图谱。聚焦伏时过大,超过115,000伏时的情况下,会引发由于过度聚焦引起的水分和蛋白迁移,导致大量水平条纹对2-DE图谱产生干扰。在此基础上建立了一个适用于淮阴苜蓿叶片的双向电泳体系。3、淮阴苜蓿对不同高温胁迫的响应为了研究淮阴苜蓿对不同高温胁迫的响应,研究分析了不同温度下(25℃、30℃、35℃和40℃)淮阴苜蓿的TTC降解能力、膜的热稳定性、丙二醛含量和蛋白质组这四个方面的变化。研究发现,温度大于30℃就会引起由于膜稳定性降低和膜脂质过氧化而导致的细胞损伤,细胞损伤随着时间的延长会逐渐恢复。与对照相比,在30v的环境条件下,淮阴苜蓿细胞活力呈先升高后降低,再升高的趋势,在35和40℃的条件下,淮阴苜蓿细胞活力呈下降趋势,这个趋势在胁迫12h后得到缓解。35和40℃均会诱导胁迫蛋白的产生,但40℃诱导产生更多的胁迫蛋白。与35℃热激处理的植株相比,40℃热激处理的淮阴苜蓿植株显示出更强的恢复能力。这些生理和蛋白质组的变化说明淮阴苜蓿具有耐受高温的能力,同时也为苜蓿耐热蛋白质组的研究提供理论基础。4、淮阴苜蓿耐热的蛋白质组学研究淮阴苜蓿在蛋白质组方面对高温胁迫的响应尚不清楚。在这个研究中,淮阴苜蓿幼苗生长在不同温度25℃(对照)和40℃(高温处理)的生长室中,分别在处理后的24、48和72h收集植株叶片作为研究材料。研究分析了高温对淮阴首蓿表型、生理和蛋白质组学的影响。在蛋白质组的分析上采用双向电泳技术对提取蛋白进行分离,4个阶段共有1.5倍以上差异的蛋白点96个,对这些蛋白点进行切胶酶解,质谱成功鉴定了96个差异表达蛋白点中的81个。其中的5个蛋白进一步进行了mRNA水平的分析。蛋白质组的分析结果对苜蓿耐热的机理将在分子水平上有一个更好的认识。通过生物信息学分析,根据蛋白的功能将这些蛋白进行分类：证实这些蛋白与代谢相关的占7%,与能量相关的占48%,与蛋白合成相关的占1%,与蛋白运输/储存相关的占6%,与转运相关的占4%,与胞内运输相关的占2%,与细胞结构相关的占1%,与信号转导7%和疾病防御相关的占24%。这些蛋白位于细胞的中的叶绿体基质(21%)、叶绿体类囊体(5%)、细胞质(41%)、内质网(9%)、微体(2%)、线粒体基质(11%)、细胞核(4%)、细胞周质(4%)、细胞质膜(1%)和液泡(2%)。在此基础上结合现有的文献报道,对这些差异蛋白质的功能、与耐热的关系以及所起的作用等方面进行了分析讨论。高温逆境下,植株需要大量的能量用于启动机体的防御性机制,比如抗氧化酶和热激蛋白。热激诱导与氨基酸代谢、蛋白合成、加工和转运相关蛋白表达量的上调,为胁迫响应蛋白的合成做准备。同时也促进了各种氨基酸的积累,增强了细胞的渗透调节能力。热激促进了淮阴苜蓿的光合作用、碳水化合物和脂肪酸的降解,为胁迫防御机制和细胞正常功能的执行提供能量和原料。蛋白的表达量下降主要发生在胁迫后的72h,这可能与叶片枯萎和物质转移有关。这些蛋白质组分析的结果对淮阴苜蓿热激响应的分子机制的认知和进一步研究具有重要信息。
【作者】李伟民；
【导师】魏臻武；
【作者基本信息】扬州大学，草业科学，2013，博士
【关键词】淮阴苜蓿；种质特性；高温胁迫；双向电泳；蛋白质组；

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