水稻卷叶基因rl_(t)的克隆及OsAGO1a的RNAi分析

【摘要】叶片是植物进行光合作用的主要器官,对植物的发育起着重要的作用。水稻叶片的姿态(长、宽、卷曲度等)影响整个植株的形态,关系到群体株型结构的塑造,是高产育种关心的主要对象之一。水稻叶片的适度卷曲能提高叶片直立性,进而提高群体透光率,改善群体中后期的基部光照条件,有利于水稻产量的提高。然而,过度卷曲的叶片降低了单位面积的光强,不利于冠层的光合作用。本文在前人的研究基础之上,克隆了水稻卷叶rl(t)基因,并研究了水稻叶片的最适卷曲度。此外,本文通过反向遗传学方法鉴定了一个新的水稻卷叶相关基因OsAG01a。最后,在基因的功能研究过程中,本文探讨了一种载体多克隆位点改造的新方法。主要研究结果如下：1)叶片的适度卷曲是水稻理想株型育种中最重要的农艺性状之一。先前的研究表明：rl(t)基因在杂合状态下使叶片适度卷曲(卷曲度约30%),具有较高的育种利用价值,能有效地增加水稻产量。本文实现了rl(t)基因的克隆,并初步研究了其控制叶片卷曲的功能。序列分析表明：在rl(t)基因精细定位的1lkb区间内仅存在一个G>T的单碱基替换,该单碱基替换位于定位区间内唯一的预测基因Roc5(Riceoutermostcell-specific)的3’末端非翻译区(3’-UTR)。荧光实时定量PCR分析表明突变体中rl(t)基因的表达量明显高于野生型。RNA干扰实验和过表达实验证实：rl(t)基因的表达量的高低控制了叶片中泡状细胞的小和大,进而控制叶片近轴面或远轴面卷曲的方向以及叶片卷曲程度的大小。这表明rl(t)基因以剂量效应方式控制水稻的卷叶性状。生物信息学分析表明：在rl(t)基因以及其他HD-ZIPⅣ(homeodomainleucinezipperclassV)家族转录因子的3’末端非翻译区中存在一个高度保守的17个核苷酸的GU富含区元件(GU-richelement)。基于哺乳动物中GU富含区元件调节mRNA稳定性的模型,我们推测rl(t)基因中GU富含区元件的单碱基突变导致ri(t)基因的过量表达进而导致叶片近轴面卷曲。本文的研究对ri(t)基因控制叶片卷曲的分子机制提供了一个新的视野。2)通过调节水稻卷叶剂量效应基因rl(t)的表达量,获得叶片近轴面卷曲或远轴面卷曲的8个不同叶片卷曲程度的卷叶近等基因系,借此研究叶片卷曲对水稻生长的影响。结果表明：叶片的正卷和反卷均能提高叶片直立度,并通过降低叶片披垂角来降低叶片的披垂度；叶片卷曲度与产量间的模型拟合表明：日本晴的产量与叶片卷曲度之间呈抛物线关系,当叶片卷曲度为5.9%时,产量最高,这说明水稻品种日本晴的叶片最适卷曲度为5.9%左右。讨论了采用相同的策略,研究并确定不同类型水稻品种最适卷曲度的可行性。3)AGO蛋白是RNA诱导沉默复合体的核心元件,在植物生长发育过程中发挥着重要作用。本研究通过分别特异地扩增OsAGO1a基因中第2外显子和第11-12外显子的片段,构建了两个干涉载体OsAGO1aI-1E、OsAGO1aI-2E。利用农杆菌介导法转化水稻品种日本晴,抑制OsAGO1a基因的表达,借此研究OsAGO1a的功能及其对水稻生长发育的影响。结果表明：抑制OsAGO1a的表达导致叶片的近轴面卷曲而对其他主要农艺性状的影响不大。4)为了探寻一种快速的、便捷的改造已知载体多克隆位点的方法,我们应用一对5’末端分别添加了多个酶切位点的引物扩增任一已知DNA片段,用两端的限制性酶酶切后连接至载体多克隆位点中,从而引入两个新的酶切位点。我们将这一方法称为衔接子引物-PCR引入法。酶切结果证实：预先设计的酶切位点已替换至载体的多克隆位点,且引入的酶切位点能被顺利切割。这说明衔接子引物-PCR引入法是一种改造已知载体多克隆位点的可行的方法。
【作者】李磊；
【导师】潘学彪；
【作者基本信息】扬州大学，作物遗传育种，2013，博士
【关键词】rl（t）；HD-GL2；GU富含区元件；卷叶；水稻；最适卷曲度；Roc5；经济性状；产量；OsAGO1a；极性发育；近远轴极性；多克隆位点；改造；衔接子引物；

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