猪精子尾部发生相关基因的研究

【摘要】精子尾部是由位于曲精细管上皮的精原干细胞经历有丝分裂、减数分裂后,在精子变态过程中形成。尾部是精子的代谢与运动器官,与精子的活动能力有密切关系,而精子的活动能力是完成受精的重要前提条件。当精子的活力低下、尾部畸形或行动方向不规则都可能导致不育。研究精子尾部形成的分子机理对于探寻精子形成及精子结构异常造成的精液品质不良的成因具有重要意义。目前的研究还无法还原精子尾部的体外生成过程。本研究选择在精子尾部起重要作用的基因Odf2、Odf3、Tektin4和Cabyr,通过克隆获得完整CDS序列,对其序列特征、时空表达规律、表达产物的亚细胞定位进行分析研究,并探索基因的过表达对体外培养精原干细胞分化的影响,从而为深入研究精子尾部发生的分子机理及调控机制奠定基础。全文结果如下：一、采用RT-PCR和RACE的方法克隆了猪Odf2、Odf3、Tektin4基因及Cabyr基因的3种剪接体cDNA序列；对所获序列利用软件分析编码氨基酸的结构、同源性比较及分子进化树的构建。结果表明Odf2基因cDNA长3300bp,编码蛋白长度为810个氨基酸,有连续的Coiledcoil结构；Odf3基因cDNA长1154bp,编码蛋白长度为193个氨基酸,序列中含有5个保守的PGP位点,经过序列多重比对,PGP位点在人类、犬、牛、小鼠和大鼠氨基酸序列中所处位置具有较高的同源性与保守性。Tektin4基因cDNA序列长1500bp,编码蛋白长度为447个氨基酸。具有TEKTIN家族保守结构域,即4个Colledcoil结构,在螺旋Helix2A和Helix2B之间存在TEKTIN家族特征的信号序列RPNVELCRD。Cabyr基因在梅山猪睾丸中出现3种剪接体,其中Cabyrl和Cabyr2编码蛋白长度为433个氨基酸,Cabyr3编码蛋白长度为382个氨基酸,在两个蛋白的N端存在RⅡa功能域。利用ClustalW分析猪Odf2、Odf3、Tektin4及Cabyr基因编码氨基酸与其它物种的同源性发现4个基因中Odf2和Odf3氨基酸序列与其他哺乳动物同源性较高,达84-97%。Tektin4为78-89%。Cabyrl编码氨基酸的同源性最低,为58-78%。利用DNAMAN构建的分子进化树符合生物学分类。二、利用半定量PCR的方法检测150日龄梅山公母猪组织器官中Odf2、Odf3、Tektin4和Cabyr基因的表达特征。结果表明Odf2和Odf3基因为睾丸特异性表达基因。Tektin4在公猪的睾丸、垂体、母猪的子宫角和输卵管中有表达,其中在睾丸中表达丰度较高。Cabyr基因在所检测的组织中均可见表达。利用荧光定量PCR的方法分析以上基因在2、30、60、90、150日龄段梅山公猪睾丸中的表达规律。结果表明Odf2、Odf3、Tektin4和Cabyr基因在2日龄和30日龄的猪睾丸中不表达,从60日龄开始表达。此时附睾尾出现少量精子,说明Odf2、Odf3、Tektin4和Cabyr基因的表达与公猪的精子发生时间一致。Odf2和Odf3基因在90日龄和150日龄的表达量显著高于60日龄的表达(P<0.01),90日龄和150日龄之间的表达量差异不显著(P>0.05)。Tektin4和Cabyr基因150日龄的表达量极显著高于60日龄和90日龄(P<0.01),60日龄和90日龄之间的表达量差异不显著(P>0.05)。60-90日龄间梅山公猪初情期启动,开始产生完整形态的精子,推测Odf2和Odf3基因在90日龄的高表达与初情期启动过程有关。三、利用融合报告基因定位法和间接免疫荧光法研究Odf2、Odf3、Tektin4和Cabyr基因编码氨基酸的亚细胞定位。将构建成功的pEGFP-C1-Odf2、pEGFP-C1-Odf3、pEGFP-C1-Tektin4和pEGFP-C1-Cabyr的质粒分别转染NIH-3T3细胞,24小时后在荧光倒置显微镜下观察。结果显示Odf2、Odf3和Cabyr融合蛋白定位于细胞质和细胞核,Tektin4融合蛋白定位于细胞核。将构建成功的pcDNA3.1-Odf2,pcDNA3.1-Odf3,pcDNA3.1-Tektin4,pcDNA3.1-Cabyr重组表达载体转化DH5α,纯化质粒并免疫小鼠,分离鼠抗猪的多克隆抗血清。pcDNA3.1-Tektin4,pcDNA3.1-Cabyr,pcDNA3.1-Odf2,pcDNA3.1-Odf3重组表达载体转染NIH-3T3细胞24小时后,将多克隆抗血清分别稀释1：50、1：100、1：200、1：300,采用间接免疫荧光法观察Odf2、Odf3、Tektin4和Cabyr基因编码氨基酸的亚细胞定位。结果发现四个基因编码氨基酸均定位于细胞质,与生物信息学预测的结果一致。自制的多抗血清能够识别目的蛋白,抗体效价在1：50最好。四、利用半定量PCR研究Odf2、Odf3、Tektin4和Cabyr基因在成熟精子RNA中的表达,结果发现仅Cabyr基因在精子中呈低丰度表达,Odf2、Odf3、Tektin4在精子中不表达。利用自制的多抗血清,采用间接免疫荧光法研究Odf2、Odf3、Tektin4和Cabyr蛋白在成熟精子中的定位。结果表明Odf2定位于精子头部的顶体和赤道区、颈部、尾部主段与中段。Odf3定位于精子的尾部主段和中段。Tektin4定位于精子头部的顶体与赤道、尾部的主段和中段。Cabyr在整个精子表面均可见荧光。说明Odf3蛋白参与精子尾部的形成。Odf2和Tektin4除了参与精子尾部的形成,可能还有其他的功能。Cabyr可能与参与精子的能量供应和精子获能有关。五、采用差速贴壁法培养猪精原干细胞并鉴定。结果表明初生仔猪睾丸分离培养的细胞符合精原干细胞的形态特征,传至第三代的细胞AKP染色为阳性,且表达精原干细胞特异性基因Oct4和CD9,说明所获得的细胞为精原干细胞。六、利用半定量PCR研究过表达Odf2、Odf3、Tektin4和Cabyr基因对猪精原干细胞体外精子发生过程相关基因表达的影响。将pEGFP-C1-f2、pEGFP-C1-Odf3、pEGFP-C1-Tektin4和pEGFP-C1-Cabyr重组质粒分别转染猪精原干细胞,另有一组同时转染4个质粒于猪精原干细胞。48小时后细胞可检测到目的基因mRNA的表达,同时转染4个质粒的细胞可以检测到4个基因同时表达。EGFP-C1-Odf2转染猪精原干细胞后可检测到减数分裂特异性表达基因Sycp3,说明Odf2基因的过表达可能会启动猪精原干细胞减数分裂的发生。同时转染4个质粒的细胞可检测到减数分裂另一特异性表达的基因Dmcl,说明可能有基因协同启动减数分裂的发生。七、利用荧光定量PCR研究RA诱导与过表达Odf2、Odf3、Tektin4和Cabyr基因对于小鼠精原干细胞(mSSCs)体外精子发生相关基因表达的影响。10-5M和10-6M的RA培养鼠精原干细胞10天后,收集细胞采用荧光定量PCR的方法检测精子发生过程相关基因的表达,结果表明RA浓度为10-5M时Dazl基因的表达量显著降低(P<0.05),Sycp3基因的表达显著上升(P<0.05),说明10-5M的RA可以使mSSCs启动减数分裂。将10-5M的RA诱导细胞10天后转染pcDNA3.1-Odf2,pcDNA3.1-Odf3,pcDNA3.1-Tektin4,pcDNA3.1-Cabyr,48小时后收集细胞,提取RNA并反转录,利用荧光定量PCR的方法检测精子发生过程相关基因的表达。结果表明经RA诱导后过表达Odf2使得Dazl基因的表达量显著降低(P<0.01),10-5M的RA诱导后过表达Odf3使得Dazl基因的表达量显著降低(P<0.05),Sycp3基因的表达量进一步上升,但组间无差异。无TP2和Prm1基因的表达,说明没有使mSSCs完成减数分裂。但RA诱导后过表达Odf2组的细胞出现类似精子尾部的突起,结合Dazl和Sycp3基因的表达说明可能精原干细胞向精子发生的方向进一步分化。
【作者】王宵燕；
【导师】李碧春；
【作者基本信息】扬州大学，特种经济动物饲养，2013，博士
【关键词】精子发生；精子尾部；梅山猪；Odf2；Odf3；Cabyr；Tektin4；亚细胞定位；精子RNA；精原干细胞；过表达；减数分裂；

【参考文献】
[1]崔英梅.课程组织的量化分析研究[D].东北师范大学,课程与教学论,2014,博士.
[2]刘廷廷.最近发展区理论指导下的高中概率教学[D].华中师范大学,学科教学,2014,硕士.
[3]陈昕鹏.基于SAN的共享存储系统的研究与实现[D].复旦大学,计算机技术,2012,硕士.
[4]贾路路.气候变化对我国金融业发展的影响研究[D].山东财经大学,金融学,2012,硕士.
[5]罗蓉.牙冠延长术的临床应用及短期内牙龈龈缘位置变化的初步探讨[D].大连医科大学,口腔临床医学,2012,硕士.
[6]涂子学.城市轨道交通行车调度人机风险分析方法及应用[D].西南交通大学,交通运输安全工程,2014,硕士.
[7]成新田,唐振民.基于主动鉴别字典学习的自主导航偏离控制算法[J].控制与决策,2015,05:947-950.
[8]郅立平.人基因治疗伦理评价原则的探讨[D].中国人民解放军军事医学科学院,情报学,2004,硕士.
[9]王晓琴.金融发展对出口商品贸易结构优化的实证分析[D].杭州电子科技大学,国际贸易学,2013,硕士.
[10]巨文姝.人体医学试验的法律问题研究[D].华侨大学,法律,2013,硕士.
[11]焦文祝.高性能亚共晶铝硅合金组织及性能研究[D].沈阳工业大学,材料加工工程,2013,硕士.
[12]孟根.《黄金史》领属范畴研究[D].内蒙古师范大学,中国少数民族语言文学,2012,硕士.
[13]蔡剑锋.聚-ADP-核糖基化在六价铬致人支气管上皮细胞损伤中的作用[D].广西医科大学,劳动卫生与环境卫生学,2013,硕士.
[14]蒋建业.湖南省电信公司数据通信的发展战略研究[D].湖南大学,2003.
[15]林德泉.新刑事诉讼法下的附条件不起诉制度研究[D].厦门大学,法律,2014,硕士.
[16]彭俊,蔡明,荣冠,周创兵,赵星光.裂纹闭合应力及其用于评价岩石微裂纹损伤[J].岩石力学与工程学报.
[17]董英.头针结合运动训练对EAE小鼠血清中IL-17和TGF-β1的影响[D].黑龙江中医药大学,康复医学与理疗学,2013,硕士.
[18]杨志杰.ABO_3（A=Ba；B=Fe，Co）钙钛矿型阴极材料的电性能及其应用[D].苏州大学,无机化学,2012,硕士.
[19]赵艳侠.钛盐混凝剂的混凝行为、作用机制、絮体特性和污泥回用研究[D].山东大学,环境工程,2014,博士.
[20]郭芳.现代企业类网站版式设计研究[D].山东大学,设计艺术学,2013,硕士.
[21]张文武.两种后路跨伤椎椎弓根螺钉内固定术治疗胸、腰椎骨折的疗效对比分析[D].河北医科大学,外科学（专业学位）,2014,硕士.
[22]周桂霞.集成设计理论及信息建模的研究[D].河北工业大学,2013.
[23]张瑜.时序模式发现算法研究与改进[D].河北工业大学,2003.
[24]杨丹.基于协同取向的县域农村公共产品供给机制优化研究[D].华中师范大学,行政管理,2012,硕士.
[25]方原柏.抓斗吊车电子秤的设计[J].冶金自动化,1989,05:6-11.
[26]李永华,卢琦,吴波,朱雅娟,刘殿君,张金鑫,靳占虎.干旱区叶片形态特征与植物响应和适应的关系[J].植物生态学报,2012,01:88-98.
[27]缪大经,周秉谦.金箔专用载体——乌金纸[J].包装世界.1996(05)
[28]谭清香.农村公路基础设施对减缓贫困的影响评估[D].中国社会科学院研究生院,农业经济管理,2003,硕士.
[29]王大炜.基于点特征从运动恢复三维形状[D].西北工业大学,计算机应用技术,2004,硕士.
[30]吴晓琳.调控房价与平衡社会利益分配[J].住宅产业.2007(04)
[31]朱林江,李崎.工业微生物基因组编辑技术的研究进展[J].生物工程学报.
[32]闫宝霞.陕西省旬阳县大沟槽金矿工业指标优化研究[D].西安建筑科技大学,矿业工程,2013,硕士.
[33]方森.中国大学生医疗保险制度改革探析[D].中国海洋大学,公共管理,2010,硕士.
[34]罗雅芸.无船承运业务若干问题研究[D].东北财经大学,国际贸易学,2003,硕士.
[35]霍晓蕊.保护理念下赊店古镇控规对策研究[D].北京建筑大学,城市规划与设计,2013,硕士.
[36]陈越.不同放牧制度对短花针茅草原群落特征和土壤的影响[D].内蒙古农业大学,农业资源利用,2013,硕士.
[37]彭杰.重庆三峡地区易滑地层路基边坡安全评价技术研究[D].重庆交通大学,道路与铁道工程,2012,硕士.
[38]高芳芳.问题解决中信息获取途径的选择偏向[D].华中师范大学,基础心理学,2014,硕士.
[39]蒋良孝,蔡之华.时序数据库中的数据挖掘研究[J].微机发展,2003,05:90-92.
[40]王宏光.创建快乐数学课堂模式的实践研究[D].河北师范大学,课程与教学论,2012,硕士.
[41]李亚男,何文军,杨为民.新型纳米碳材料的应用新进展[J].化工新型材料,2014,03:179-182.
[42]彭国栋.基于E网格数值预报模式AREM并行计算研究[D].国防科学技术大学,计算机科学与技术,2012,硕士.
[43]龚小妹.汶川地震文学书写[D].安徽大学,中国现当代文学,2014,硕士.
[44]王伟.几类二阶变系数非齐次线性微分方程的通解[J].新乡学院学报(自然科学版),2013,06:408-410.
[45]王晔.纳米结构铌酸锂和铌酸钾的合成制备及性能研究[D].浙江大学,材料科学与工程,2013,硕士.
[46]杨西建.FGF21在对乙酰氨基酚诱导的小鼠急性肝功能衰竭中的作用研究[D].吉林大学,生物化学与分子生物学,2014,硕士.
[47]立早.第五届全国石油科技情报工作会议在北京举行[J].石油地球物理勘探,1991,04:472.
[48]雷蕾.中小企业网络营销管理系统的设计与实现[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[49]刘金亮.基于主题模型的个性化新闻推荐系统的研究与实现[D].北京邮电大学,计算机科学与技术,2013,硕士.
[50]龚伟.聚合物太阳能电池中载流子复合与传输机制及器件特性的研究[D].北京交通大学,2014.