microRNAs调控运动性心脏肥大相关信号通路的研究

【摘要】运动性心脏肥大是运动员心脏的主要形态变化,左右心室均可发生肥大,但通常以左心室的肥大为主,其肥大程度与运动方式、强度和持续时间有关。运动员心脏的机能改变通常表现为：静息心动徐缓、每搏输出量增加、心力储备增大。运动性心脏肥大组织结构的重塑主要表现为心肌纤维增粗肥大,心脏毛细血管新生,这构成了运动性心脏收缩性和有氧代谢功能的增强。运动性心脏超微结构的重塑主要表现为心肌细胞内高尔基复合体及其功能结构增多,粗面内质网增多,心房特殊颗粒增多且功能活性增强,线粒体及其功能结构多,肌原纤维增多,肌质网和横管系统发达,核糖体和糖原增多。超微结构的重塑性改变构成了运动性心脏内分泌功能变化,心肌有氧氧化和能量产生增多,心肌收缩能力增强,心力储备增强的结构基础。但是运动性心脏肥大究竟如何形成,其发生的分子信号机制和调节机制是什么,相关信号通路中各信号分子的表达究竟如何变化,目前尚有待研究。miRNA是一种内源性、单链、由18-25个单核苷酸组成的非编码小RNA。专家预测在人类基因组中,miRNA基因不少于1000条,同时miRNA能够对超过三分之一的人类蛋白编码基因的表达进行调控。miRNA与多种疾病及发育过程的基因表达有关,是一种重要的调节物质。最初,学者对miRNA的研究主要集中在对肿瘤发生的调节和对肿瘤生长的抑制方面,发现改变miRNA表达模式可能会引起在癌症发生及进展过程关联的细胞增殖上调或细胞凋亡下调。然而,从2005年开始,越来越多的研究表明,miRNA在哺乳动物心血管系统中发挥着极其重要的生物学功能,这些发现引起了学者的极大关注。目前有关microRNAs与运动性心脏肥大的研究刚刚起步。关于到底是哪些microRNAs在运动性心脏肥大中起作用?这些作用和运动性心脏肥大信号通路之间是否有关联?到底是何种关联?目前国内外均未有详细的研究。本研究在前人研究的基础上,探讨microRNAs在运动心脏肥大中的作用,以及调控运动性心脏肥大相关信号通路的机制,为揭示运动性心脏肥大的分子机制提供理论依据。目的：通过建立大鼠运动性心脏肥大模型,对比正常心肌和肥大心肌内miRNA的表达差异,分析介导心脏肥大形成的相关信号通路,探索运动性心脏肥大形成的分子机制。为揭示运动性心脏肥大的分子机制提供理论依据。方法：1.根据Femandes和Oliveira等的研究结果,经8周游泳运动训练,建立SD大鼠心脏肥大模型。通过对比分析对照组大鼠和运动组大鼠的血压、心率、心脏/体重比和左心室/全心比,镜下观察两组大鼠心肌细胞形态,确认运动组大鼠心脏发生肥大性改变,并通过检测病理性心脏肥大相关标志物基因的表达,确认心脏发生的肥大为非病理性肥大,进而证实运动性心脏肥大模型建立成功；2.应用miRNA生物芯片技术,分析对照组和模型组大鼠心肌内miRNA表达图谱的差异；3.应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术和Western-blot技术,分析两条与细胞生长、增殖相关信号通路——ERK和PI3K/AKT/mTOR,在运动性心脏肥大中的作用；4.应用生物信息学的方法预测调控运动性心脏肥大中相关信号通路的miRNA,并通过TaqManmicroRNAAssay方案,对相应miRNA进行定量分析；5.利用RT-PCR和Western-blot技术对miRNA靶点基因及其相应蛋白的表达水平进行研究,分析miRNA调控运动性心脏肥大中相关信号通路的可能机制。结果：1.8周游泳运动后,SE组大鼠体重增长较为缓慢,较SC组大鼠体重略轻,但两组体重之间未见显著性差异(274.8±17.9gvs.267.2±13.4g,P>0.05);SE组大鼠血压较SC组略呈下降的趋势,但两组间血压未见显著性差异(114.7±6.8mmHgvs.110.4±6.1mmHg,P>0.05)。而SE组大鼠的静息心率出现了显著的降低(340.8±11.5bpmvs.298.6±13.2bpm,P<0.05)；与SC组大鼠全心指数(全心重/体重,3.1±0.16mg/g)相比,SE组大鼠全心指数(4.3±0.45mg/g)在8周游泳运动后增加了38.7%(P<0.05)。与SC组大鼠左室指数(2.1±0.09mg/g)相比,SE组大鼠左室指数(2.7±0.13mg/g)增加了28.6%(P<0.01)。组织切片镜下观察,心肌纤维着色均匀,结构正常,心肌纤维呈短柱状,相互连接成网,细胞核卵圆形,大小分布均匀,心肌横纹清晰可见,与SC组大鼠心肌细胞直径(11.3±1.2μm)相比,SE组大鼠心肌细胞直径(13.6±1.3μm)显著增加。结果表明,经过8周游泳运动大鼠心脏发生显著的肥大性改变,且左心室肥大较为明显；2.8周游泳运动后,与SC组相比,SE组大鼠心肌ANP的表达量(1.461±0.271vs.1.350±0.179,P>0.05),α-actin的表达量(1.474±0.358vs.1.317±0.305,P>0.05)均为发生显著的改变,α-MHC/β-MHC的比值也未见明显改变(P>0.05),提示运动组大鼠心脏未发生病理性改变。结果表明,SE组大鼠心脏未发生病态改变,运动性心脏肥大SD大鼠模型成功建立；3.8周游泳运动后,利用microRNA生物芯片对大鼠心肌中microRNA的表达进行检测并对比,结果表明,相对于SC组,SE组大鼠心肌中miR-21.miR-144.miR-145.miR-130a.miR-130b*、miR-1.miR-653*、miR-3120、miR-103-1*、miR-200b、miR-377*、miR-224*、miR-183*、miR-331*、miR-3568、miR-742、miR-758*、1et-7a-2*的表达量发生了显著的上调,而miR-124、miR-3597、miR-352、miR-181a、miR-152、miR-26b、miR-126*、miR-598-3p、miR-743a、miR-376b-5p、miR-129-2*、miR-204、miR-219-5p、miR-497、miR-142-3p、miR-153*、miR-30c-1*、miR-451、miR-199a-5p、miR-223、miR-181b、miR-664-1*、miR-674-3p、miR-338、miR-146a、miR-322、miR-29b-2*、let-7d、1et-7f、let-7a、let-7a-1*/7c-2的表达量则发生了显著的下调；4.8周游泳运动后,相对于SC组,SE组ERK1/2的蛋白表增加了9%(0.793±0.095vs.0.864±0.063),phosphoThr202/Tyr204-ERK1/2的蛋白表达量减少了5%(0.812±0.016vs.0.771±0.046),AKT1的蛋白表达量增加了2%(1.209±0.094vs.1.185±0.114),mTOR的蛋白表达量增加了2%(0.466±0.048vs.0.476±0.023),但这些蛋白表达的改变于SC组和SE组间均未见显著性差异(P>0.05).phosphoser473-AKT增加了46%(0.698±0.037vs.1.019±0.115,P<0.01),phosphosSer2448-mTOR的表达量增加了38%(0.362±0.034vs.0.450±0.034,P<0.05)。结果表明,在8周游泳运动诱导的运动性心脏肥大中,ERK信号通路未被激活,而P13K/AKT/mTOR信号通路发挥了重要的作用；5.8周游泳运动后,miRNA芯片检测结果显示,与SC组大鼠相比,SE大鼠左心室心肌中miRNA-21.144和145的表达量分别上调了202%(381±21vs.1150±32,P<0.01).114%(2250±178vs.4820±178,P<0.01)和116%(2105±161vs.4555±128,P<0.01),而miRNA-124的表达量下降了54%(2205±48vs.1015±119,P<0.01)；结果表明,8周游泳运动上调了miRNA-21.144和145的表达,下调了miRNA-124的表达；6.8周游泳运动后,niRNA实时荧光定量PCR结果显示,与SC组大鼠相比,SE大鼠左心室心肌中miRNA-21.144和145的表达量分别上调了152%(100%±19%vs.252%±13%,P<0.01).128%(100%±20%vs.228%±17%,P<0.01)和101%(100%±17%vs.201%±8%,P<0.01),而miRNA-124的表达量下降了38%(100%±20%vs.62%±15%,P<0.05)；结果证实,8周游泳运动上调了niRNA-21、144和145的表达,下调了miRNA-124的表达；7.通过生物信息学的方法预测niRNA-21、124、144和145的靶点,结果表明,miRNA-124靶向P13K(p110α),miRNA-21和144靶向PTEN,miRNA-145靶向TSC2;8.8周游泳运动后,与SC组相比,SE组大鼠左心室心肌中的P13K(p110)的mRNA表达量上调了213%(1.184±0.165vs.3.710±0.780,P<0.01),蛋白表达量上调了36%(0.832±0.057vs.1.132±0.128,P<0.05);结果表明,在运动性肥大的心脏中,PI3K(p110)的表达量发生了显著的上调；9.8周游泳运动后,与SC组相比,SE组大鼠左心室心肌中的PTEN的mRNA表达量下调了50%(1.043±0.065vs.0.524±0.118,P<0.05),蛋白表达量下调了37%(1.211±0.109vs.0.763±0.092,P<0.05)；结果表明,在运动性肥大的心脏中,PTEN的表达量发生了显著的下调；10.8周游泳运动后,与SC组相比,SE组大鼠左心室心肌中的TSC2的mRNA表达量下调了55%(0.977±0.068vs.0.446±0.099,P<0.05),蛋白表达量下调了22%(0.817±0.042vs.0.637±0.048,P<0.05),phosphoThr1462-TSC2的蛋白表达上调了48%(0.582±0.017vs.0.861±0.059,P<0.01)。结果表明,在运动性肥大的心脏中,TSC2的表达量发生了显著的下调。结论：1.根据Femandes和Oliveira等的研究结果,在本研究中成功复制了运动性心脏肥大SD大鼠模型；2.8周游泳运动训练未激活ERK信号通路,而PI3K/AKT/mTOR信号通路被激活;3.8周游泳运动使得运动诱导的肥大心肌中microRNA的表达发生了显著的变化；4.miRNA-124通过靶向PI3K(p110α),miRNA-21和144通过靶向PTEN,以及miRNA-145通过靶向TSC2参与了心肌肥大信号PI3K/AKT/mTOR的调控；5.microRNA调节PI3K/AKT/mTOR信号通路介导了运动性心脏肥大的发生。
【作者】马智超；
【导师】张钧；
【作者基本信息】扬州大学，动物与人类运动比较科学，2013，博士
【关键词】游泳；运动；心脏；肥大；miRNA；信号通路；

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