叶酸修饰的异土木香内酯长循环脂质体研究

【摘要】脂质体作为新型给药载体可以减少化学治疗药物的毒副作用,增加肿瘤部位的药量,提高药物疗效,是当前药物载体研究热点之一。本文首先介绍了国内外脂质体研究进展,针对脂质体作为药物载体的局限性,详细分析了目前脂质体的改性途径及其发展趋势。异土木香内酯(IAL,isoalantolactone)是从我国传统中药土木香中提取的主要活性成分,为倍半萜类药物,具有显著的抗癌作用。但是,IAL在体内半衰期短,易清除,难以直接用于临床。本文以IAL为模型药物,制备由叶酸、PEG和HSA修饰的IAL靶向长循环脂质体(f-HSA-PEG-IAL脂质体),一方面为开发新型长循环脂质体提供合理可行的途径,另一方面为IAL药物的临床应用提供了新的剂型和思路。本文主要研究内容及结果如下：1.聚乙二醇二胺(PEG-bis-amine)合成与表征采用叠氮化物还原法和苯磺酰氯加胺取代法制备PEG-bis-amine,经计算,叠氮化物还原法得率48.2%,苯磺胺酰氯加胺取代法得率54.4%。叠氮化物还原法产物熔程为48.4-51.1℃,苯磺胺酰氯加胺取代法的熔程为44.4～53.6℃,对照品熔程为48.7～50.5℃,前者产物与对照品相近,说明其产物纯度较高。因此,前者较后者具有较高的合成效率,反应条件易控制,收率较高。前者产物红外光谱表明,在3426cm-1、1577cm-1处为PEG-NH2的N-H键的伸缩振动和弯曲振动；1109cm-1处强吸收峰为C-O-C的特征峰。1H-NMR(CDCl3)谱图显示,8=2.86ppm为与NH2基相连的α位亚甲基质子峰,8=3.48ppm为与氧相连的亚甲基质子峰,δ=3.55～3.63是-CH2-CH2-O-的亚甲基质子峰,表明PEG-bis-amine合成成功。2.叶酸-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺(Folate-PEG-DSPE)合成与表征采用叶酸、PEG-bis-amine、和DSPE为原料,经过三步反应合成Folate-PEG-DSPE。通过NHS活化γ-羧基,和PEG-bis-amine末端氨基反应,生成Folate-PEG-NH2,然后采用琥珀酸酐等含有咪唑基团的化合物先对DSPE的羟基进行活化,合成N-琥珀酰-DSPE,最后再将两者混合反应,生成Folate-PEG-DSPE.其冻干品熔程为187.8～206.6℃。红外光谱表明,在1675cm-1处有强吸收峰,说明PEG-bis-amine和Folate及SUC-DSPE发生反应,形成的酰胺键。另外,在1608cm-1、1574cm-1处的峰为叶酸分子中苯环的吸收峰,也说明化合物含有叶酸组分。在1721cm-1处的峰为DSPE分子中所包含的两条脂肪酸链上羧基的吸收峰,说明化合物中也含有DSPE组分。同样,根据核磁共振谱结果所示,δ=1.26ppm和δ=1.59ppm分别为DSPE分子中脂肪酸链-CH3-(CH2)14和-CH3-(CH2)14-CH2-质子峰,δ=2.25ppm和为DSPE分子中CO-CH2的质子峰,δ=2.40ppm为叶酸分子中谷氨酸的β、γ亚甲基的质子峰,δ=3.75为PEG分子中-CH2-CH2-O-的亚甲基质子峰,说明化合物中含有叶酸、DSPE和PEG组分,该化合物为Folate-PEG-DSPE。以PEG为主要反应物计算最终的率为19.7%3.叶酸修饰的IAL长循环脂质体的制备及表征经过优化过程,筛选出采用薄膜蒸发法制备叶酸修饰的IAL长循环脂质体的处方和工艺,制备出空白传统脂质体、f-PEG-IAL脂质体及f-HSA-PEG-IAL脂质体,电镜下均为球形,分散良好,可以看到PEG形成的“外壳”以及HSA使“外壳”增厚的现象,含HSA脂质体Zeta电位为-21.54mV,粒径为136.27nm,粒子之间的相互斥力较大,使连接HSA的脂质体具有良好的稳定性。4.叶酸修饰的IAL长循环脂质体体外释放及细胞摄取试验IAL传统脂质体、f-PEG-IAL脂质体和f-HSA-PEG-IAL脂质体中IAL释放为骨架扩散型,药物释放较为缓慢。IAL传统脂质体、f-PEG-IAL脂质体和f-HSA-PEG-IAL脂质体24h累计溶出度仅为42.35%、12.45%和14.23%,120h累计释放率为87.10%、29.38%和48.40%,三者体外释药过程符合Higuchi方程：y=ax1/2。MPM对含有PEG和HSA-PEG的脂质体的吞噬率较普通脂质体的低,吞噬率大小依次为IAL传统脂质体>f-PEG-IAL脂质体>f-HSA-PEG-IAL脂质体。此外,加入小鼠空白血浆可以增加MPM对于脂质体的吞噬率,相比之下,f-HSA-PEG-IAL脂质体较f-PEG-IAL脂质体具有更强的抗血浆调理素蛋白结合的能力,可有效降低MPM吞噬作用,在体内具有良好的长循环特性。5.叶酸修饰的IAL长循环脂质体大鼠体内药代动力学研究通过大鼠尾静脉注射IAL传统脂质体、f-PEG-IAL脂质体和f-HSA-PEG-IAL脂质体,研究了三种脂质体在大鼠体内的药代动力学过程,相互之间并进行了比较。大鼠静脉给药8h后,三者大鼠体内药物浓度分别为347ng/mL、999ng/mL和1171ng/mL。给药12h后,IAL传统脂质体对照组的大鼠体内药物浓度低于检测限,给药24h后,f-PEG-IAL脂质体和f-HSA-PEG-IAL脂质体血药浓度分别为761ng/mL和851ng/mL。f-HSA-PEG-IAL脂质体下降速度较f-PEG-IAL脂质体更加缓慢,说明HSA作为抗调理素蛋白可进一步延长脂质体体内循环时间。5天后,进行二次注射脂质体,产生的ABC现象,其药代动力学参数发生变化,药时曲线较符合一室模型。f-HSA-PEG-IAL脂质体在首次用药为IAL原药、IAL传统脂质体、f-PEG-IAL脂质体和f-HSA-PEG-IAL脂质体组中的半衰期t1/2分别是f-PEG-IAL脂质体的1.06、2.76、2.74和1.87倍,AUC0→12值为1.19、2.85、2.18和1.27倍,表明含HSA的IAL脂质体在多次注射脂质体条件下,较仅含有PEG的IAL脂质体更不易为MPS系统吞噬,稳定性更高,预示着其在体内保留时间更长,具有更高的生物利用度,有可能具有更好的肿瘤靶向能力。6.叶酸修饰的IAL长循环脂质体抑瘤性研究MTT实验结果表明,f-PEG-IAL脂质体和f-HSA-PEG-IAL脂质体对于HeLa、MCF-7和PANC-1肿瘤细胞增殖均有较为明显的抑制作用。两者对HeLa、MCF-7和PANC-1细胞的半抑制率(IC50)值,依次分别为29.41μmol/L、9.24μmol/L和21.14μmol/L和48.87μmol/L、20.66μmol/L和29.67μmol/L,远小于分散剂的IC50值(>100μmol/L);其中前者的IC50值大于后者,说明因HSA较大的空间位阻影响的细胞对于脂质体的摄取。AnnexinV-FITC/PI双标记流式细胞术结果表明,在药物浓度为100μmol/L,培养时间为24h、36h、48h和72h,细胞凋亡率分别为39.2±2.93%、66.8±4.37%、85.8±3.32%和90.9±3.86%,对照组(48h)为0.21±0.03%,说明随着培养时间的延长,凋亡率不断升高,细胞由早起凋亡逐渐发展为晚期凋亡及坏死。同时说明f-HSA-PEG-IAL脂质体可以诱导肿瘤细胞凋亡,这可能是其抗癌机制之一。本文采用人乳腺癌MCF-7细胞系裸鼠皮下种植法制作肿瘤模型,按10mg/kg体重给药,三种IAL脂质体的肿瘤抑制作用依次为f-HSA-PEG-IAL脂质体>f-PEG-IAL脂质体>IAL传统脂质体,最终抑制率分别为84.8%、71.4%和45.8%。毒性研究结果表明,给药后,裸鼠体重不仅没有减少,反而有所增加,说明IAL对肿瘤细胞的亲和力大于正常细胞。组织形态学的结果表明,10mg/kg的f-HSA-PEG-IAL能有效抑制肿瘤细胞的生长。
【作者】纪桢；
【导师】樊君；
【作者基本信息】西北大学，制药工程，2013，博士
【关键词】脂质体；叶酸；长循环；靶向给药系统；异土木香内酯；药代动力学；抑瘤率；

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