乳清蛋白肽美拉德反应产物的制备及其抗氧化作用机理研究

【摘要】乳清蛋白不仅具有良好的营养特性和功能特性,而且美拉德反应产物具有较好的抗氧化功能,近年来大量研究表明乳清蛋白的美拉德反应产物具有较好的抗氧化功能,与合成抗氧化剂相比,具有使用安全的特点,因而在食品应用中受到广泛的关注。但是,目前关于美拉德反应体系的研究中,多集中于蛋白质与还原糖的反应模式,而关于蛋白质水解物与还原糖体系的美拉德反应研究却很少。本试验以乳清蛋白碱性蛋白酶水解物为原料与葡萄糖发生美拉德反应,制备得到乳清蛋白肽美拉德反应产物(WheyproteinpeptideMaillardreactionproducts,WPP-MRPs),研究了WPP-MRPs的制备条件、分离纯化工艺及结构分析,并对WPP-MRPs的体外抗氧化活性及诱导肿瘤细胞凋亡作用进行了研究,最后研究了羟基自由基氧化体系(HRGS)对WPP-MRPs结构和功能的影响。论文的研究内容和研究结果如下：1、通过单因素试验和响应面优化试验,以还原力为考察指标,研究了WPP-MRPs的最佳制备工艺条件,结果表明,在葡萄糖浓度为8%、温度为94℃、时间为3.2h条件下制备得到的WPP-MRPs还原力最高,此时还原力(A700nm)达到0.944±0.05。而反应过程中,体系pH值不断降低(P<0.05),褐变程度加深(P<0.05),荧光强度先增加后下降(P<0.05),游离氨基不断减少(P<0.05)。2、以浓度为O.lmg/mL的丁基羟基茴香醚(BHA)和O.lmg/mL的抗坏血酸(Vc)为对照,对WPP-MRPs的抗氧化活性进行了综合评价,结果表明,当WPP-MRPs浓度为40mg/mL时抗氧化能力分别为：还原力(A700nm)为0.39±0.04,羟基清除率为99.37±2.01%,2,2’-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐(ABTS)自由基清除率为81.58±1.33%,Cu2+螯合率为40.47±2.15%,Fe2+螯合率为8.34±0.36%,硫代巴比妥酸反应物质(Thiobarbituricacid-reactivesubstances,TBARS)值为1.13±0.07mg/L。此浓度的WPP-MRPs羟基清除率和金属螯合力(Cu2+,Fe2+)显著高于Vc和BHA(P<0.05);而还原力显著低于Vc(P<0.05),但与BHA相比差异不显著(P>0.05);ABTS自由基清除率略低于Vc和BHA;TBARS抑制作用低于BHA但好于Vc。3、试验研究了温度、pH值、光照、金属离子和过氧化氢对WPP-MRPs抗氧化稳定性的影响。结果表明,WPP-MRPs的抗氧化活性受热影响较小,在50～110℃下加热时还原力、羟基和ABTS自由基清除率变化差异不显著(P>0.05)；在偏碱性环境中的抗氧化活性大于偏酸性环境中,pH值为8.0时还原力、羟基和ABTS自由基清除率最高(P<0.05)；在不同光照条件下放置25d,WPP-MRPs抗氧化活性均显著下降(P<0.05),其中在室外自然光条件下降低最显著(P<0.05),其次是室内自然光和避光；金属离子Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Zn2+对WPP-MRPs的还原力、羟基和ABTS自由基清除率的影响不显著(P>0.05),而金属离子Cu2+、Fe2+、Fe3+和氧化剂H202能够显著降低WPP-MRPs的抗氧化活性(P<0.05)。因此,在加工、储藏过程中应注意WPP-MRPs在偏碱、避光及避开铜铁器具和H202条件下使用,这样可以发挥其良好的抗氧化作用。4、试验采用中空纤维超滤膜对WPP-MRPs进行分级得到Ⅰ(分子量<0.8kD)、Ⅱ(0.8kD<分子量<51dD)、Ⅲ(分子量>5kD),对还原力最强的Ⅱ(A700nm为1.55±0.06)再进行凝胶过滤色谱纯化,最佳凝胶纯化条件为：以SephadexG-25为纯化介质,采用1.0x50cm纯化柱,择蒸馏水为洗脱液,缓冲液流速为0.2mL/min,进样量为1.5mL,在该条件下进行分离纯化后得到三个不同分子量范围的组分WM,(2780.75～7436.78D)、WM2(813.08-2780.75D)和WM3(54.36-813.08D)。经过抗氧化活性研究得出WM2抗氧化性较好(P<0.05),在浓度40mg/mL时WM2的还原力(A700nm)为0.68±0.04,对羟基自由基清除能力99.95±±2.70%,ABTS自由基清除率为88.63±3.04%,Cu2+螯合率为45.41±1.12%,Fe2+螯合率为11.28±±0.05%,TBARS值为0.83±0.06mg/L.5、结构分析结果表明,WPP-MRPs的赖氨酸含量显著下降(P<0.05),较乳清蛋白肽(WPP)的赖氨酸含量降低了0.86%,精氨酸、组氨酸及脯氨酸含量也有一定程度下降(P<0.05)；傅立叶变换红外光谱(FTIR)和圆二色光谱(CD)分析表明,糖分子连接到乳清蛋白肽分子上,使WPP的二级结构中α螺旋和p转角的含量减少(P<0.05),β折叠和无规则卷曲的含量增加(P<0.05),说明美拉德反应使WPP的二级结构由有序向无序转变；荧光光谱分析表明,在420～430nm处出现新的吸收峰,说明产物生成了具有荧光性的生色团物质；紫外吸收光谱扫描结果表明,WPP经过美拉德反应后在220nm和280nm处紫外吸收强度增加,说明生色团物质含量增加。6、试验研究了WM2对宫颈癌细胞Hela及结肠癌细胞Ht-29的抑制作用,结果表明,WM2能够以剂量依赖和时间依赖的方式抑制癌细胞的增殖,作用12h和24h后对Hela细胞的IC50分别为39.12mg/mL和35.91mg/mL,对Ht-29细胞的IC50分别为35.80mg/mL和31.94mg/mL;通过倒置显微镜观察细胞结构,发现经WM2作用以后,细胞出现典型的凋亡特征,细胞收缩,胞质浓缩,形成胞浆丝,细胞失去贴壁能力；流式细胞检测结果进一步说明了WM2能够诱导Ht-29细胞发生凋亡。WM2抗氧化活性与Ht-29抑制率的相关性分析表明,对癌细胞抑制率与羟基清除率的相关系数为0.91(P<0.05),与ABTS自由基清除率的相关系数为0.90(P<0.05),与还原力的相关系数为0.94(P<0.05)。7、试验研究了HRGS对WM2结构和功能的影响,结果表明,随着H202浓度的增加和氧化时间的延长,WM2中的二聚酪氨酸含量显著上升(P<0.05),活性巯基、游离氨基含量均显著下降(P<0.05);WM2的乳化功能受到影响,在0.1mmol/L的H202氧化1h后乳化性和稳定性略有上升(P>0.05),随着H202的浓度增加和氧化时间的延长乳化性和稳定性又显著下降(P<0.05)。本论文证明了WPP-MRPs及其分离纯化产物具有较强的抗氧化活性,而且稳定性良好,适合各类食品加工,因此可以广泛用于食品、保健品中。因此本研究为拓宽乳清蛋白的应用及开发天然安全的抗氧化剂提供了依据和思路。
【作者】孙常雁；
【导师】孔保华；
【作者基本信息】东北农业大学，农产品加工及贮藏工程，2014，博士
【关键词】乳清蛋白肽；美拉德反应；抗氧化活性；分离纯化；细胞；羟基自由基氧化体系；

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