不同乳源蛋白致敏性的评估

【摘要】牛奶过敏是发生在婴儿和儿童中的一种常见疾病,在婴儿出生后前三年发生牛奶过敏的比例约为2.5%。对于无法获得母乳的婴儿来说,婴儿配方粉是非常重要的一种母乳替代品。目前的婴儿配方粉,尤其是早产儿配方粉大多是以牛奶为蛋白基料开发的,而牛奶中含有的酪蛋白、a-乳白蛋白、β-1g等常见蛋白质对婴儿尤其是早产儿来说是非常重要的潜在致敏原,这使得过敏问题更加突出。因此,低致敏性婴儿配方乳粉的乳源基料的研究与开发备受医学界和营养学界的关注。虽然可以利用水解、高压、加热、甲基化等方法降低牛奶的致敏性,但是这些处理方法会导致牛奶中营养物质被破坏,口感大大降低甚至会出现苦味等问题,因此寻找出一种未经处理或者不需要高强度处理便具有低致敏性的乳源将是成功开发低致敏性婴儿配方乳粉的福音。虽然婴儿配方粉的常用乳源是牛奶,但是人们普遍认为山羊奶、绵羊奶、马奶和驴奶为患有牛奶蛋白过敏的婴儿提供了一种可接受的替代配方粉。已有相关研究表明马奶和羊奶比牛奶更接近母乳,因此本课题从免疫学的角度来分析马奶或羊奶是否比牛奶更适合作为低致敏配方粉的乳源基料,为低致敏配方粉以及早产儿配方粉的开发提供理论基础。本实验利用Balb/c小鼠为实验动物,对比了牛奶、羊奶和马奶对小鼠体重和肠壁血管通透性的影响；通过MTS、ELISA方法检测了小鼠脾细胞增殖、血清和肠液IgE、IgGl、血浆组胺分泌水平的变化；通过制备石蜡切片、HE染色检测了牛奶、羊奶和马奶对小鼠小肠和肺脏形态变化的影响；通过荧光定量PCR、ELISA和流式细胞术从分子和蛋白水平检测了小鼠脾脏T淋巴细胞中Th细胞的分化,结果提示：脾细胞增殖实验表明,未添加ConA时,β-lg组的刺激指数显著大于牛奶组、羊奶组和马奶组和对照组(P<0.01)；添加ConA时,β-lg组刺激指数显著高于牛奶、羊奶、马奶和对照组,但各实验组的刺激指数SI值都高于未添加ConA组,说明在ConA的诱导作用下,β-1g、牛奶、羊奶和马奶对脾淋巴细胞的刺激作用增强。利用ELISA方法检测各实验组中血清和小肠液中IgE水平的变化,结果表明,β-1g和牛奶刺激组小鼠血清中IgE的水平显著高于羊奶组、马奶组和对照组(P<0.01),而羊奶组和马奶组之间差异不显著(P>0.05)；B-1g刺激组小鼠肠液中的IgE水平显著高于牛奶组、羊奶组、马奶组和对照组(P<0.01),而牛奶刺激组小鼠肠液中的IgE水平显著高于羊奶组、马奶组和对照组(P<0.01),羊奶、马奶以及对照组小鼠肠液中的IgE水平没有显著差异(P>0.05)。此外我们还检测了血清和小肠液中和IgG1水平的变化,结果表明,β-lg和牛奶刺激组小鼠血清中的IgGl水平显著高于羊奶组、马奶组和对照组小鼠血清中的IgG1水平(P<0.05),而羊奶组和马奶组之间差异不显著(P>0.05)：β-1g刺激组小鼠肠液中的IgG1水平显著高于牛奶组、羊奶组、马奶组和对照组(P<0.05),而牛奶刺激组小鼠肠液中的IgG1水平显著高于羊奶组、马奶组和对照组(P<0.01),羊奶、马奶以及对照刺激组小鼠肠液中的IgG1水平没有显著差异(P>0.05)。利用ELISA试剂盒检测血清和脾细胞培养上清中细胞因子IL-4、IL-10、IL-17和IFN-γ分泌水平的变化。结果显示,13-1g刺激组血清中IL-4的含量显著高于牛奶、羊奶、马奶以及对照组(P<0.01),而牛奶刺激组血清中IL-4的含量显著高于羊奶、马奶和对照组(P<0.01),羊奶、马奶和对照组血清中IL-4的含量没有显著差异；β-1g和牛奶组血清中IL-10的含量显著低于羊奶、马奶和对照组(P<0.01),但是羊奶、马奶和对照组血清中IL-10的含量差异不显著(P>0.05)；β-1g和牛奶刺激组血清中IL-17的含量显著高于羊奶、马奶和对照组(P<0.01),羊奶和马奶组血清中IL-17的含量显著高于对照组(P<0.05);β-1g和牛奶组血清中IFN-γ的含量显著低于羊奶、马奶和对照组(P<0.001),而羊奶、马奶和对照组血清中IFN-γ的含量没有显著差异(P>0.05)。培养上清中四种细胞因子分泌水平的变化基本与血清检测结果一致。利用ELISA试剂盒检测组胺水平的变化,结果显示B-lg刺激组中组胺水平显著高于牛奶、羊奶、马奶和对照组(P<0.05),牛奶刺激组组胺水平显著高于羊奶组、马奶组和对照组(P<0.01),而羊奶组、马奶组和对照组之间差异不显著(P>0.05)。组织学病理切片实验结果表明,和对照组相比,β-lg刺激组和牛奶刺激组肠腺中的杯状细胞增多,说明伴有卡他性肠炎,上皮细胞有少量脱落、坏死。马奶组和羊奶组也表现为杯状细胞增多,但是肠绒毛正常,未见杯状细胞增多及肠上皮细胞脱落和坏死现象；和对照组相比,B-lg组、马奶组和牛奶组表现出肺泡管壁增厚,伴有毛细血管,动脉和静脉淤血,充血,间质性肺炎,肺泡塌陷等。但是羊奶组基本正常,偶见少量淤血。各组小鼠肠壁血管通透性检测结果表明,牛奶刺激组小鼠的血管通透性显著高于羊奶、马奶和对照组(P<0.01),羊奶、马奶和对照组小鼠血管通透性没有显著差异(P>0.05)。为了进一步探讨牛奶过敏反应是否与Th1,Th2,Th17和Treg细胞失衡有关,本研究提取了各样品刺激后脾细胞中的RNA,反转录后用荧光定量PCR检测辅助性T细胞分泌产生的代表性细胞因子和核转录因子表达的变化,结果显示,牛奶刺激组IL-4和IL-17mRNA的表达量显著高于羊奶组和马奶组,而羊奶和马奶刺激组IFN-y和IL-10mRNA的表达量显著高于牛奶组,四种辅助性T细胞的核转录因子GATA-3、Foxp3、RORγt和T-bet的表达变化趋势与相应的代表性细胞因子相似。利用流式细胞术三色法检测脾细胞内辅助性T细胞的四种代表性细胞因子含量,结果显示牛奶刺激组表达IL-4和IL-17的脾细胞数量显著高于羊奶、马奶和对照组,而羊奶和马奶刺激组表达IL-4和IL-17的脾细胞数量没有显著差异。牛奶刺激组表达IFN-γ和IL-10的脾细胞数量显著低于羊奶和马奶刺激组,而羊奶和马奶刺激组表达IFN-γ和IL-10的脾细胞数量没有显著差异。这一结果与血清和细胞培养上清中细胞因子IL-4、IL-10、IL-17和IFN-γ的检测结果基本一致。利用流式细胞术检测CD4+和CD8+细胞比率,结果显示各刺激组中CD3+脾细胞中CD4+T细胞要高于CD3+脾细胞中CD8+T细胞的百分数,但是各组之间差异不显著(P>0.05)。总之,本课题利用Balb/c小鼠成功的建立了致敏动物模型,并利用免疫学方法对比了牛奶、马奶和羊奶之间致敏性差异,证实马奶和羊奶的致敏性低于牛奶,更适合用作低致敏配方粉或早产儿配方粉的乳源基料。这些结果将为低致敏配方粉或早产儿配方粉的开发提供理论依据。
【作者】段翠翠；
【导师】霍贵成；
【作者基本信息】东北农业大学，食品科学，2014，博士
【关键词】牛奶；马奶；羊奶；致敏性；小鼠；

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