α-突触核蛋白基因在AVM致王鸽脑神经细胞凋亡中的作用研究

【摘要】阿维菌素类(Avermectins,AVMs)药物属农畜两用杀虫剂,因其卓越的疗效目前在世界范围内被广泛应用。已有研究表明,阿维菌素类药物可对多种类群的非靶动物产生毒性效应。目前国内外有关AVMs毒理学研究主要集中在无脊椎动物和包括人类在内的哺乳动物方面,而关于鸟类AVMs毒理学的研究几乎未见报道。我们实验室的前期研究发现,美国王鸽对AVM敏感,亚慢性AVM中毒可致王鸽出现明显的中枢神经系统中毒症状,进一步的研究表明体内、外条件下AVM均可致鸽脑神经细胞呈现细胞凋亡样形态学和生化变化。应用抗鸽α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)基因的抗体检测急性AVM中毒后α-Syn基因在鸽脑组织中的表达情况时发现中毒后α-Syn基因的表达显著高于对照。已有结果表明,α-Syn基因可参与人类神经细胞凋亡的发生,进而导致神经退行性疾病。为了考察α-Syn基因的表达在AVM诱导的鸽脑神经细胞凋亡中的作用,本研究在复制鸽亚慢性AVM中毒模型、体外条件下制备鸽胚脑神经细胞AVM染毒模型的基础上,检测了鸽脑组织中凋亡相关基因、细胞因子相关基因和热休克蛋白相关基因的表达变化以及敲低α-Syn基因前后鸽胚脑神经细胞中上述指标的变化情况,探讨了α-Syn基因表达在AVM诱导的神经细胞凋亡中的作用。主要结果如下：(1)以发育7-8天的鸽胚为试验材料,采用标准方法对鸽胚脑神经细胞进行分离、提取,采用Neurobasal培养基和L-谷氨酰胺的代替产品GlutaMAX对鸽胚脑神经细胞进行了优化培养。NSE免疫细胞化学染色在优化培养后的脑神经细胞中呈强阳性反应,表明所培养的神经细胞纯度高、活性好,可用于后续各项试验指标的检测。(2)成功复制了鸽饮食性AVM亚慢性中毒模型,中毒动物表现出明显的神经症状,如站立不稳、精神沉郁、共济失调等。(3)使用StealthRNA成功转染了原代培养的鸽胚脑神经细胞,最佳转染组合为24孔板每孔加1μLRNAiMAX和0.9μLsiRNA,该组合的转染效率大于80%。筛选出鸽α-Syn基因的有效干扰序列α-Syn-Stealth(142),该序列可使鸽胚脑神经细胞中α-Syn基因mRNA表达水平降低至对照组的44%。(4)AVM对优化培养后的鸽胚脑神经细胞半数致死浓度在15-20μg/L之间。(5)应用TUNNEL和HOECHST染色法检测了AVM对鸽胚脑神经细胞的凋亡诱导情况,证实AVM能够诱导神经细胞凋亡,且呈明显的剂量-效应关系。(6)体内、外条件下AVM染毒可导致鸽大脑、小脑和视叶三种脑组织和鸽胚脑神经细胞促凋亡基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、cytochromec和Bax的表达水平上调、而抑凋亡基因Bc1-2的表达水平降低,提示体内、外条件下AVM均可诱导神经细胞发生凋亡。敲低α-Syn基因后促凋亡基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、cytochromec和Bax的mRNA表达较敲低前显著降低,而抑凋亡基因Bcl-2的mRNA表达较敲低前显著升高,说明α-Syn基因在AVM诱导的神经细胞凋亡中起发挥重要作用。(7)体内、外条件下AVM染毒可导致鸽脑组织和鸽胚脑神经细胞α-Syn基因的表达水平上调；敲低α-Syn基因后该基因对AVM的敏感性显著降低。(8)体内、外条件下AVM染毒可导致鸽脑组织和鸽胚脑神经细胞UPP通路三种代表性水解酶：糜蛋白酶、肽基谷氨酰基水解酶和胰蛋白酶活性发生不同程度的降低,提示AVM可影响UPP通路的功能。(9)体内条件下AVM染毒可导致鸽脑组织中细胞因子IL-1β、IL-4、IL-6、IL-12β、IL-26、TNF-α和IFN-α的mRNA表达不同程度升高,IFN-γ的mRNA表达降低；体外条件下AVM染毒均可导致鸽胚脑神经细胞中细胞因子IL-1β、IL-4、IL-6和TNF-α的mRNA表达升高,IFN-γ的mRNA表达降低；敲低α-Syn基因后细胞因子IL-1β、IL-4、IL-6、TNF-α和IFN-γ的mRNA表达较敲低前均显著下降。上述结果表明α-Syn基因可能介导了神经炎症的发生,进而导致细胞凋亡。(10)体内、外条件下AVM染毒可导致鸽脑组织和鸽胚脑神经细胞热休克蛋白基因Hsp60、Hsp70和Hsp90的mRNA表达发生不同程度升高；敲低α-Syn基因后Hsp60、Hsp70和Hsp90的mRNA表达较敲低前均显著下调。这些试验结果表明AVM染毒诱导了鸽脑组织和鸽胚脑神经细胞的适应性应激反应；敲低α-Syn基因后AVM对神经细胞的毒性作用降低,因此应激反应程度降低。综上,本研究从分子水平证明AVM可致鸽脑神经细胞发生凋亡,α-Syn基因在此过程中发挥重要作用。AVM作用后UPP通路发生障碍,导致α-Syn基因表达发生异常上调,该基因的异常上调表达即可直接诱导凋亡的发生又可经由炎症途径间接引发凋亡。此外AVM染毒还诱导了鸽脑组织和鸽胚脑神经细胞的适应性应激反应。本研究为探讨AVM致鸟类神经毒性的机理提供理论基础和试验依据。
【作者】李铭；
【导师】李术；
【作者基本信息】东北农业大学，基础兽医学，2014，博士
【关键词】阿维菌素；α-突触核蛋白；细胞凋亡；王鸽；

【参考文献】
[1]罗超.二氧化锰和四氧化三铁对碳纳米管的改性及其对Cd(Ⅱ)和Cr(Ⅵ)的吸附研究[D].兰州大学,2014.
[2]边江南.UWB室内定位算法的研究[D].南昌航空大学,通信与信息系统,2013,硕士.
[3]倪志伟,蔡庆生,史东辉.神经网络专家系统及其数据挖掘技术的探讨[J].系统工程学报,2001,01:61-65.
[4]刘芹.论未成年人权益的法律保护[D].华东政法学院,刑法学,2004,硕士.
[5]刘好智.新乡地区地表水地下水联合运用的实践与认识[J].中原地理研究.1985(01)
[6]葛萌竹.我国《小企业会计准则》相关问题研究[D].首都经济贸易大学,会计学,2013,硕士.
[7]王奕喆.基于相关检测方法的钢轨测长技术的研究[D].哈尔滨理工大学,检测技术及自动化装置,2012,硕士.
[8]姚飞.新型N-取代聚乙炔螺旋聚合物材料的制备及其应用[D].北京化工大学,材料科学与工程,2013,硕士.
[9]刘晓芳.一类二阶奇异代数微分方程的解的研究[D].上海师范大学,基础数学,2013,硕士.
[10]罗安民.“学历教育合训”学员领导能力培养的管理方法研究[D].国防科学技术大学,2004.
[11]石培哲.全球价值链分工体系中企业集群定位研究[D].北京交通大学,2012.
[12]刘凤琴,马俊海.中小企业信息化管理软件开发思想与方法探讨[J].企业经济,2003,06:106-108.
[13]王顺晃.微型机控制飞剪定尺[J].冶金自动化,1986,06:49-51.
[14]束洪春,张加贝.水机电耦合系统建模及暂态分析[J].电力系统自动化,2008,13:26-30.
[15]罗飞,许玉格,曹建忠.基于目的层预约的电梯群控系统建模与控制[J].控制与决策,2006,10:1159-1162.
[16]严矿林,肖小华,李攻科.表面增强拉曼光谱在食品安全分析中的应用[J].化学通报,2014,05:388-395.
[17]胡凤国.含事件类词语的汉语名词短语语义结构信息数据库的研制[D].中国社会科学院研究生院,语言学及应用语言学,2003,硕士.
[18]易舟鑫.基于橡胶拉伸的实验研究[D].重庆交通大学,工程力学,2012,硕士.
[19]李然.银行自助设备管理信息系统[D].天津大学,软件工程,2013,硕士.
[20]黄学.基于组织模块性与技术模块性匹配的全球研发系统架构设计规则[D].浙江大学,企业管理,2014,博士.
[21]彭晓群,吴丰,张延华.柴达木盆地小梁山地区混积岩储层测井评价[J].石油地球物理勘探,2012,S1:136-139+151+170+162.
[22]夏瑜,吴小俊,冯振华.基于特征贡献度的meanshift视频跟踪算法[J].控制与决策,2012,07:1021-1026.
[23]高振斌,钱富才,刘丁.基于最大互信息指标的对偶控制研究[J].自动化学报,2008,08:1008-1012.
[24]祝景愉.论清代自首制度及其在司法实践中的运用[D].吉林大学,法律史,2013,硕士.
[25]沈璐敏.美国货币政策跨国溢出效应的区域差异研究[D].浙江工商大学,金融学,2013,硕士.
[26]孙久川.行政立法公众参与研究[D].山东大学,法律（专业学位）,2013,硕士.
[27]李建锋.脉冲耦合神经网络在图像处理中的应用研究[D].中南大学,计算机应用技术,2013,博士.
[28]刘达瑾.β-受体阻滞剂对急性心肌梗死患者左室收缩功能的影响[D].山西医科大学,心血管内科,2002,硕士.
[29]张若琳.莫言小说中的“世界性因素”[D].宁夏大学,中国现当代文学,2014,硕士.
[30]范穗强.加味柴胡桂枝汤合并文拉法辛治疗中重度抑郁症的回顾性研究[D].南方医科大学,中西医结合临床,2012,硕士.
[31]赵宇乐.视译在英汉口译教学中的应用[D].吉林大学,翻译,2014,硕士.
[32]张倩.我国大学师生关系的理论与实践探索[D].延安大学,课程与教学论,2014,硕士.
[33]屠宏,吴宏江.数据挖掘在网络学习者学习特征分析系统中应用[J].远程教育杂志,2004,05:41-43.
[34]阿部信行,佐佐木信悦,王建民.日本落叶松人工林的间伐试验五年后的林分结构变化和林分生长量[J].辽宁林业科技.1981(02)
[35]李忠娟.离散时间变结构控制及其仿真研究[D].广东工业大学,控制理论与控制工程,2004,硕士.
[36]赵琼,刘占存.白点的检测、形成原因与预防[J].一重技术.2005(03)
[37]唐阿楠.永吉县土地利用变化及驱动力分析[D].吉林农业大学,环境工程,2012,硕士.
[38]孙天培.跨语言信息检索的查询消歧及查询扩展技术研究[D].内蒙古大学,计算机科学与技术,2013,硕士.
[39]苏丹.低场脉冲核磁共振信号数字接收平台的分析与研究[D].中国科学院研究生院（电工研究所）,电机与电器,2003,硕士.
[40]周海蛟.基于物联网应用的政府公务车管理平台解决方案的研究[D].南京理工大学,电子与通信工程,2012,硕士.
[41]边捷.纳米阵列图案表面浸润性研究[D].南京大学,材料物理与化学,2014,博士.
[42]王婷.新闻侵权规避研究[D].黑龙江大学,新闻学,2012,硕士.
[43]柴马竞.基于数字相敏解调技术的电容耦合电阻层析成像系统研究及应用[D].浙江大学,控制科学与工程,2014,硕士.
[44]袁新龙.江苏省企业电子商务及其商业模式应用研究[D].东南大学,2004.
[45]郭薇.大学生道德困境问卷的初步编制及相关因素分析研究[D].西北大学,应用心理学,2013,硕士.
[46]王萍,宋书君,王新征,王岩,倪善芹.岩性油藏配套解释技术[J].石油地球物理勘探,2003,05:557-560+461-462+582.
[47]张泰然.氧化石墨烯的制备及光致发光性质研究[D].浙江大学,2013.
[48]罗晔.女性主义认知研究[D].湖南师范大学,社会学,2013,硕士.
[49]王员.露天矿山爆破作业模糊综合评价应用研究[D].西南交通大学,机械工程,2014,硕士.
[50]童薇.5-12岁儿童反事实情绪的发展及影响因素[D].西南大学,发展与教育心理学,2013,硕士.