组织工程人角膜内皮的体外重建及其动物移植试验

【摘要】人角膜内皮层（HCE）由单层的六角形人角膜内皮细胞（HCE细胞）镶嵌而成，是前房房水和角膜基质之间的渗漏性屏障，HCE细胞质膜上所拥有的诸多膜运输蛋白通过发挥“泵”功能使整个角膜处于半脱水状态，在维持角膜正常厚度和其透明性进而保障眼睛发挥正常视功能方面具有不可替代的作用。遗憾的是，成人的HCE细胞丧失了增殖能力，而且数量还在逐年减少，HCE单层完整性的维持只能靠邻近HCE细胞的扩大和移行来实现。一旦受到病原体感染、机械损伤和非生理性胁迫等，HCE细胞死亡的速率更快，轻者会造成不可逆角膜病变——角膜内皮功能失代偿（cornealendothelialdysfunction），重者将会致盲——角膜内皮盲（primarycornealendotheliopathy），角膜内皮病盲在因角膜病变所导致的视力障碍中位于第二位。角膜移植是目前治疗角膜内皮病盲的唯一办法，因HCE异常仅仅是由于HCE细胞数量不足造成的，故绝大多数角膜内皮病盲患者均可通过角膜移植而治愈，但由于捐献角膜数量的高度匮乏，致使可用于角膜移植的供体角膜材料严重不足，众多角膜内皮病盲患者无法通过角膜移植重见光明。目前，组织工程人角膜内皮（tissue-engineeredhumancornealendothelium,TE-HCE）被公认为是治疗角膜内皮病盲的天然HCE的等效替代物，已成为广大角膜内皮病盲患者恢复视力和复明的唯一希望。但迄今为止，仍没有可用于临床HCE移植的TE-HCE产品问世。本文在前期研究工作的基础上，利用表型、核型和功能蛋白表达正常且没有致瘤性的人角膜内皮单克隆细胞株细胞（monoclonalhumancornealendothelialcells,mcHCE细胞）为种子细胞，以理化性能正常、安全性高且生物相容性理想的薄化去上皮层修饰羊膜（modifieddenuded-epitheliumamnioticmembrane,mdAM）为载体支架，在体外重建出了形态和组织结构正常的TE-HCE，并利用家猫和猕猴进行了动物角膜的穿透性后板层角膜移植试验，旨在获得可使移植动物角膜长期维持透明的TE-HCE，为可用于临床HCE移植的TE-HCE新产品的生产和临床应用奠定基础。用于TE-HCE体外重建的种子细胞为来自非转染无致瘤性HCE细胞系（utHCEC01）的第38代mcHCE细胞。在用作种子细胞开展TE-HCE体外重建之前，分别对其细胞属性、功能蛋白的表达以及致瘤性进行了检测和鉴定。检测结果显示，第38代mcHCE细胞呈近似六角形的多边形内皮样细胞形态，透明度高，形态大小均一，细胞群体倍增时间为41.07h，染色体数目为2n=46条，表明该细胞株细胞的生长状态良好，分裂增殖能力旺盛；第38代mcHCE细胞仍维持有标志蛋白——人血管内皮生长因子受体-2（Flk1）和人IV型胶原蛋白的阳性表达，表明该细胞株细胞保持有HCE细胞的固有属性；细胞连接蛋白的免疫荧光检测结果显示，第38代mcHCE细胞仍保持有紧密连接蛋白1（ZO-1）、N-钙粘蛋白（N-Cadherin）、间隙连接蛋白-43（CX-43）和整联蛋白αv/β5（Integrinαv/β5）的阳性表达，表明该细胞株细胞具有在细胞间以及细胞与细胞外基质间形成细胞连接的潜能；第38代mcHCE细胞还维持有细胞膜运输蛋白——人Na+/K+ATPase、人氯离子通道蛋白-2（hCLCN2）、Na+/HCO3-协同转运蛋白（hSLC4）和人水孔通道蛋白-1（AQP1）的阳性表达，表明该细胞株细胞具有发挥正常膜运输功能的潜能；第38代mcHCE细胞在裸鼠皮下接种后没有肿瘤出现，证实该细胞株细胞没有致瘤性。综合上述检测和鉴定结果，证明第38代mcHCE细胞形态结构、属性和功能正常，且没有致瘤性，可以被用作TE-HCE体外重建的种子细胞。本文利用胰酶-EDTA倒置消化法对去上皮层羊膜进行薄化处理，再使用专用信号分子包被，制得薄化mdAM。在用作载体支架进行TE-HCE体外重建之前，分别对其进行理化性质、生物学性质以及其与第38代mcHCE细胞的生物相容性进行检测和评价。结果显示，薄化mdAM只有基底膜和致密层组成，且上皮面光滑平整；厚度均一，平均厚度约为28.47μm；透明度和透光率良好，可见光区的透光率在90%以上；重金属含量符合国家对可吸收植入型医用生物材料的要求。薄化mdAM无热源和眼刺激性；皮下植入后无炎症反应且降解速度比瑞济生物羊膜快；且与第38代mcHCE细胞具有良好的生物相容性。综上所述，薄化mdAM具有良好的理化和生物学性能，安全性高，且与mcHCE细胞生物相容性良好，可以被用作TE-HCE体外重建的载体支架。本文以上述mcHCE细胞为种子细胞、以薄化mdAM为载体支架，用含20%FBS的DMEM/F12(1:1)完全培养液，在37℃、5%CO2的培养条件下进行了TE-HCE的体外重建。每24h茜素红染色结果显示，重建96h后种子细胞便可在载体支架上形成完整连续的细胞层，细胞与细胞间着色清晰，细胞呈近似六角形内皮样形态，细胞密度为3487±99.04个/mm2；组织结构和超微结构鉴定结果显示，体外重建96h所得的TE-HCE具有完整连续的角膜内皮细胞单层，多角形细胞中具有一定数量的线粒体和内质网，细胞与细胞间、细胞与载体支架间具有多处细胞连接样结构，与正常HCE的组织结构和超微结构相似。免疫荧光检测结果显示，体外重建96h所得的TE-HCE仍维持有细胞紧密连接蛋白1（ZO-1）、N-钙粘蛋白（N-Cadherin）、间隙连接蛋白-43（CX-43）和整联蛋白αv/β5（Integrinαv/β5）的阳性表达，表明体外重建96h所得的TE-HCE具有形成紧密连接复合体进而形成前房房水与角膜基质间渗漏性屏障的潜能。综上所述，体外重建96h所得TE-HCE具有与正常HCE相似的形态特征、组织结构和超微结构，可以作为正常HCE的等效替代物，被认为可以用于角膜内皮病盲的临床治疗。为了进一步评价所重建的TE-HCE在体内是否具有正常HCE的生理功能。本文选用自身角膜内皮细胞没有增殖能力的家猫和猕猴作为实验动物。首先撕除实验眼的后弹力层和内皮层，然后进行带DiI荧光标记的TE-HCE和mdAM（对照组）的后板层角膜移植。移植后用裂隙灯显微镜、角膜测厚仪和眼压计跟踪观察其透明度、厚度和眼压的变化情况，并在家猫移植104天，猕猴移植181天时取材进行DiI荧光标记、茜素红染色及细胞密度、组织结构和超微结构的离体鉴定，此外家猫还进行了房水蛋白变化的鉴定。结果显示，家猫和猕猴TE-HCE移植眼的角膜均未出现水肿和排斥等不良反应，角膜厚度逐渐下降，并逐渐恢复透明；而mdAM实验眼，角膜水肿严重且不透明；但TE-HCE移植眼、mdAM移植眼和正常对照眼的眼压在观察期间均在上下波动，没有明显的相关性。离体检测结果显示，家猫和猕猴TE-HCE移植眼角膜中央移植区的内皮细胞均带有DiI荧光标记，且形态大小均一，多为六角形镶嵌内皮样形态，细胞密度分别为2573.33±0.59个/mm2和2780.00±0.77个/mm2，与他们各自正常对照眼的形态和细胞密度相近，而mdAM移植眼角膜中央移植区均没有内皮细胞，这表明，家猫和猕猴TE-HCE移植眼角膜中央移植区的内皮细胞均来自所植入的TE-HCE，且具有与正常对照眼相似的形态特征和细胞密度。家猫和猕猴TE-HCE移植眼角膜的组织结构和超微结构与正常对照眼角膜相似，但猕猴TE-HCE移植眼角膜在移植181天后HCE细胞仍没有分泌形成新的后弹力层。家猫TE-HCE移植眼和正常对照眼房水蛋白的二维电泳的分析结果显示，TE-HCE移植眼与正常对照眼房水蛋白分离斑点的重复性较好，匹配的Corr系数达到0.8以上。综上所述，TE-HCE在家猫和猕猴体内具有正常HCE的生理功能，能够维持家猫和猕猴移植角膜的正常厚度和长期透明性。综上所述，利用表型、核型和功能蛋白表达正常且没有致瘤性的mcHCE细胞为种子细胞，以理化性能正常、安全性高且生物相容性理想的薄化mdAM为载体支架，在体外重建96h后即可获得形态特征和组织结构近似正常HCE的TE-HCE，且移植到自身角膜内皮细胞无增殖能力且撕除后弹力层和内皮层的家猫和猕猴角膜上后，能够重塑出形态特征、细胞密度、组织结构和超微结构与正常HCE基本一致的角膜内皮细胞单层，且能够维持家猫和猕猴移植角膜的正常厚度及长期透明性。这些研究结果表明该TE-HCE可以作为天然HCE的等效替代物，用于角膜内皮病盲的临床治疗，为众多角膜病盲患者重建光明带来希望，这在再生医学领域具有重要意义。
【作者】马西亚；
【导师】樊廷俊；
【作者基本信息】中国海洋大学，细胞生物学，2014，博士
【关键词】单克隆人角膜内皮细胞；薄化去上皮层修饰羊膜；组织工程人角膜内皮；家猫；猕猴；角膜内皮移植；

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