喜树碱衍生物通过透明质酸纳米微乳经皮给药作用于瘢痕修复的研究
【摘要】透明质酸纳米微乳经皮药物释放体系，在皮肤渗透、定量给药、药物缓释、延长药效和浅表层病灶区定位方面体现了诸多优势。10,11-亚甲二氧基喜树碱（MD-CPT）是喜树碱衍生物的代表，具有很高的生物活性，能够有效地阻碍DNA复制，阻止有丝分裂，抑制细胞增殖，是良好的抗肿瘤制剂。但是，MD-CPT的疏水性、内酯环不稳定性等理化性质限制了其体内应用。透明质酸纳米微乳作为MD-CPT的载体，可以克服MD-CPT的水难溶性、促进机体吸收、提高生物利用度、增加药物靶向性、减少毒副作用、维持血药浓度、延长半衰期和提高药效。瘢痕疙瘩（KD）被认为是一种良性肿瘤，其特征是成纤维细胞过度增殖，且受刺激易复发和加重病情，因此本文将载MD-CPT透明质酸纳米微乳应用于瘢痕疙瘩的修复研究，建立了一种温和无创的经皮给药治疗途径。对透明质酸进行修饰，成功制备了双亲性透明质酸单甘脂衍生物（HA-GMS）。通过红外、核磁检测证实了单甘酯成功地交联到HA多糖主链上，以FITC为荧光标记，以乙二胺为链接壁，利用硫脲键将FITC共价修饰在EDA-HA-GMS多糖主链上，得到FITC-HA-GMS，可以对HA-GMS载体材料进行定位示踪与定量分析。溶血实验表明，HA-GMS的溶血率均小于5%，符合生物医用材料对溶血率的要求，具有较好的血液相容性。通过MTT法检测了HA-GMS的细胞毒性。采用超声乳化法，成功制备了不同组分配比的载MD-CPT的HANs纳米微乳，平均粒径是50~200nm，zeta电位绝对值是10~20mV，带负电，均一性较好。通过透射电镜观察，纳米粒均为完整的球形，大小均一，分布均匀，几乎没有聚集的现象，稳定性良好。通过体外模拟实验，考察了HANs纳米微乳在皮肤表面的稳定性，HANs纳米微乳在pH4.0~7.4形态几乎没有变化，在pH>7.4是纳米微乳表现出不规则的形状，而且部分颗粒出现崩解的现象，说明HANs纳米微乳在皮肤弱酸性环境下可以有效地递送药物。MD-CPT/HANs纳米微乳用于透皮扩散研究，角质层透过试验：0~4h呈时间依赖性递增，达到平衡时累积渗透量Qt为660.7±20.5μg/cm2，明显高于对照组。全皮渗透性测定：Qt为51.7±9.5μg/cm2明显低于角质层透过量，随时间呈S型变化趋势。不同HA-GMS：MD-CPT质量配比制得的载药纳米微乳的透皮扩散效率不同。RhodamineB标记HA-GMS，利用荧光显微镜观察到载药纳米乳透过角质层到达真皮层的拟动态过程，4h内，部分载药纳米微乳已经到达真皮层，实现透皮。血药浓度与尿样检测，证明了HANs纳米载体对MD-CPT具有缓释的作用，多余的MD-CPT进入了血液循环，参与体内的新陈代谢，最终被排出体外，不会成为机体负担。活体成像研究体内分布，进一步验证了MD-CPT在给药区皮下组织的滞留时间较长，药物浓度较高，形成了局部临时药物贮库，可以不断渗透到浅表层病灶区，实现持续给药、延长药效的目的。另外，药物含量：肾>肝>脾，进一步说明MD-CPT参与了新陈代谢，并避开了对喜树碱类药物十分敏感的消化道等组织器官。与HSF、HUVECS、MCF-7、N2a等不同细胞株作用比较，证明了MD-CPT对细胞生长抑制、细胞吞噬和细胞周期调节都是有选择的，效果明显倾向于分裂活跃的增生性细胞。MD-CPT对瘢痕成纤维细胞（KF）的抑制呈浓度依赖性。KF对FITC-HANs-MD-CPT细胞吞噬是一个时间依赖性的动态的过程，由胞外扩散到胞内再到细胞核内。将MD-CPT/HANs作用于瘢痕皮肤，角质层变得膨胀、疏松，局部呈现筛孔的结构，促进渗透。荧光显微镜证明了Rhodamine-HANs-MD-CPT透过瘢痕疙瘩表皮直达真皮层的病变部位。MD-CPT/HA-GMS作用KF细胞12h，处于S期的细胞增加，24h，48h，处于S与G2/M的细胞均急剧减少，超过90%的细胞处于G0/G1期，停止有丝分裂，出现了老化和凋亡的趋势。实时荧光定量RT-PCR的结果，PAI-1表达水平下调，但是TGF-β、Smad3、Smad7上调，推测TGF-β/SMAD—>PAI-1被Smad7阻断。WesternBlot显示Smad2/3磷酸化水平显著下降，印证了Smad7通过阻止Smad2/3磷酸化进而阻断TGF-β/SMAD信号通路，使下游基因PAI-1表达水平下降，从而抑制瘢痕疙瘩再生。综上所述，通过体外、体内实验评价了双亲性的透明质纳米微乳经皮给药体系的生物安全性，皮肤渗透性，细胞特异性及药代动力学特性，并应用于治疗瘢痕。研究表明，喜树碱衍生物通过透明质酸纳米微乳经皮给药有望成为瘢痕修复的治疗途径。
【作者】高媛媛；
【导师】陈西广；
【作者基本信息】中国海洋大学，生物化学与分子生物学，2014，博士
【关键词】透明质酸；纳米微乳；喜树碱衍生物；经皮给药；瘢痕疙瘩；
【参考文献】
[1]慕德俊,戴冠中.基于并行结构实现修正的扩展Kalman滤波计算[J].自动化学报,1995,01:104-109.
[2]田力.乐亭县政府执行力的提升对策研究[D].燕山大学,公共管理,2014,硕士.
[3]曹婷婷.异基因造血干细胞移植治疗恶性血液病206例临床分析[D].中国人民解放军医学院,内科学,2013,硕士.
[4]房曼.我国制造业上市公司费用粘性问题研究[D].长安大学,会计学,2013,硕士.
[5]郑克宁.管道机器人的研制[D].浙江大学,2006.
[6]罗毅平,周笔锋.时滞扩散性复杂网络同步保性能控制[J].自动化学报.
[7]周瑶.我国绿色土地税费制度研究[D].湖南师范大学,环境与资源保护法学,2013,硕士.
[8]赵进尚.高压真空开关新型操动机构的动特性研究[D].华北电力大学（河北）,机械设计及理论,2004,硕士.
[9]程英杰.银行保险发展比较及我国未来发展对策分析[D].对外经济贸易大学,国际贸易,2004,硕士.
[10]郭亚男.岚河流域径流变化规律及其影响因素分析[D].郑州大学,水文学及水资源,2013,硕士.
[11]左燕峰.轴流通风机叶轮沿径向压力损失分布的研究[D].东北大学,工程热物理,2010,硕士.
[12]李平静.微萃取与在柱富集毛细管电泳联用技术及其在元素形态分析中的应用[D].武汉大学,2010.
[13]邱欣.一株捕食桑白粉菌分生孢子的类酵母真菌的发现与研究[D].西南大学,微生物学,2014,硕士.
[14]常彩.上海市社会长期护理保险缴费率研究[D].上海工程技术大学,社会保障,2014,硕士.
[15]王涌鹏,罗佳,白剑,梁宜勇.高精度长焦距测量系统反射镜安装误差分析[J].红外与激光工程,2014,02:562-568.
[16]林忠.依法执教与教师职业道德修养[D].广西师范大学,思想政治教育,2003,硕士.
[17]李黎.基于游客感知的木兰山国家地质公园科普旅游开发研究[D].湖北大学,人文地理学,2012,硕士.
[18]夏义堃.公共信息资源的多元化管理体制研究[D].武汉大学,2005.
[19]庞莹.对乙酰氨基酚电化学传感器的研究[D].辽宁师范大学,2014.
[20]薛芝敏.Th17通路在酒精性肝病发病机制中的作用及白藜芦醇对其治疗作用机制的初步研究[D].河北医科大学,内科学,2013,硕士.
[21]徐赞.教育实习指导教师工作动机与挑战调查研究[D].东北师范大学,课程与教学论,2012,硕士.
[22]郝立文.120MN自由锻水压机操作系统改造[J].锻压技术,2014,12:75-78.
[23]唐澈.钢—混凝土梁节点试验研究和有限元分析[D].西南交通大学,桥梁与隧道工程,2013,硕士.
[24]杨晓珂.两类新型太阳能电池材料的理论研究[D].山东大学,理论与计算化学,2013,硕士.
[25]徐花艳.基于线结构光的沥青路面构造深度算法研究[D].长安大学,信号与信息处理,2013,硕士.
[26]傅同庆.浅谈DP凹陷的层速度转换[J].石油地球物理勘探,1983,03:271-277.
[27]王冠一.宋代石刻篆文研究[D].吉林大学,汉语言文字学,2013,硕士.
[28]肖成.奇异方程组的定常和非定常迭代算法的收敛性[D].复旦大学,计算数学,2012,硕士.
[29]孙晶.大学变革中的组织惯性问题研究[D].浙江工业大学,企业管理,2012,硕士.
[30]胡琰.Ad Hoc网络中避免路由断裂的AODV算法改进[D].湖南大学,计算机技术,2011,硕士.
[31]王珊.广州近海海域综合监控管理信息系统的设计与应用研究[D].中国科学院研究生院（广州地球化学研究所）,2004.
[32]朱静.长三角预防兽医学博士论坛2014集锦[J].中国家禽,2014,12:34-40.
[33]朱博.普通小麦BBAA亚基因组在异源六倍体轨迹中转录组的进化研究[D].东北师范大学,遗传学,2014,博士.
[34]雷小文.基于基层损坏评价的预防性补强方法研究[D].武汉工业学院,岩土工程,2012,硕士.
[35]何永静.益心安神法治疗室性早搏（心气亏虚证）的临床研究[D].成都中医药大学,中西医结合临床,2012,硕士.
[36]张红.基于高效的SSH协议的运维审计系统研究与实现[D].湖南大学,软件工程,2011,硕士.
[37]张鹏.企业年金税收优惠政策研究[D].上海工程技术大学,社会保障,2011,硕士.
[38]周海,郑新军,唐立松,李彦.准噶尔盆地东南缘多枝柽柳、白刺和红砂水分来源的异同[J].植物生态学报,2013,07:665-673.
[39]高亮.阿尔茨海默病中高血压对大脑皮层厚度和认知功能的影响[D].兰州大学,生物医学工程,2013,硕士.
[40]夏洪艳.从广告主角度探讨电视媒体的广告营销策略[D].厦门大学,2001.
[41]刘飞平.宁波民营企业员工归属感提升研究[D].宁波大学,企业管理创新与发展战略（专业学位）,2014,硕士.
[42]朱超.不同氮肥对早实核桃（Juglans regia L.）叶片部分特征和果实品质影响的研究[D].河南农业大学,果树学,2012,硕士.
[43]吴丽君.英语专业学生汉译英中的名词化研究[D].杭州电子科技大学,英语语言文学,2013,硕士.
[44]唐琳峰,叶胜威,郑秀,唐雄贵,廖进昆,刘永.石墨烯光调制器研究进展[J].激光杂志,2013,06:1-4.
[45]胡自新.制造业计算机辅助企业管理信息系统[J].管理信息系统.1995(03)
[46]赵希人.二阶数字锁相环的研究及参数自校正[J].自动化学报,1986,02:180-184.
[47]戴飞菲.地震主题漫画的多模态话语对比分析[D].杭州电子科技大学,英语语言文学,2013,硕士.
[48]杨春江.外科临床分离菌耐药性监测及产ESBLs菌耐药基因型的研究[D].江西医学院,外科学,2003,硕士.
[49]张雪波,方勇纯,马博军.基于虚拟势场法的全局收敛视觉路径规划(英文)[J].自动化学报,2008,10:1250-1256.
[50]刘建浩.浅埋煤层大采高工作面煤壁片帮机理研究[D].西安科技大学,采矿工程,2014,硕士.
