基于壳聚糖的纳米凝胶口服药物输送载体的构建及其透粘膜机理的研究

【摘要】化学治疗是抑制恶性肿瘤最常用也是最有效的治疗方式。目前，大多数用于化学治疗的抗癌药物一般采用静脉滴注的给药方式。静脉滴注的给药方式虽然直接有效，但同时也具有耗时长，副作用大，无法连续治疗的缺点。口服抗癌药物相对施药方便，耗时短，病患依从度高，但胃肠道和肝脏的首过效应使得口服化学疗法难以实现。壳聚糖(Chitosan,CS)作为一种天然的阳离子多糖，具有良好的生物相容性和组织亲和性，它能够可逆性的打开小肠上皮细胞间紧密连接，使药物通过细胞旁途径进入人体循环，在口服药物输送领域具有较好的应用前景。对CS进行羧甲基化修饰，制备出中性条件下可溶的羧甲基壳聚糖（Carboxymethylchitosan,CMCS）,红外光谱检测证实了羧甲基基团成功连接在壳聚糖分子骨架上，乌氏粘度法测定CMCS的分子量为12kDa，元素分析结果表明CMCS的脱乙酰度和羧甲基取代度分别为81%和92%。分别以3H-吲哚菁型生物荧光标示染料（Cy3NHSEster）和异硫氰酸荧光素（FITC）为荧光标记，共价连接在CS和CMCS主链上（Cy3-CS，FITC-CMCS）,用于对载体材料定位示踪。以离子交联法制备CS纳米凝胶（CS-nanogels，CS-NGs），平均粒径和zeta电位分别为187.8nm和+33.4mV，以聚电解质凝聚法合成了CS/CMCS纳米凝胶（CS/CMCS-nanogels,CS/CMCS-NGs），平均粒径和zeta电位分别为202.4nm和-40.7mV。透射电镜观察CS-NGs和CS/CMCS-NGs均为球形，其中CS/CMCS-NGs形状规则，粒径大小均一，分散均匀，而离子交联法制得的CS-NGs为不规则球形，粒径分布较宽，并有团聚现象出现。溶血实验表明，CS-NGs和CS/CMCS-NGs的红细胞溶血率均低于5%，符合医用材料对于溶血率的要求。蛋白吸附实验表明，CS-NGs和CS/CMCS-NGs对牛血清蛋白（Bovineserumalbumin，BSA）的非特异性吸附率较低，结合溶血实验结果表明两种纳米凝胶有较好的血液相容性。采用MTT法检测了CS-NGs和CS/CMCS-NGs的细胞毒性，结果表明两种纳米凝胶对胎鼠成纤维细胞（MEFs）、人脐静脉内皮细胞（HUVEC）、人结直肠腺癌细胞（Caco-2）具有良好的细胞相容性，当浓度为1000μg/mL时，对人乳腺癌细胞（MCF-7）表现出潜在的细胞毒性。以盐酸阿霉素（Doxorubicinhydrochloride，DOX）为模型药物，通过离子交联/聚电解质凝聚法结合透析的方法制备了包载DOX的壳聚糖纳米凝胶（DOX:CS-NGs）和包载DOX的壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米凝胶（DOX:CS/CMCS-NGs），其平均粒径分别为209.6nm和279.3nm；zeta电位分别为32.8mv和-33.8mv；DOX包封率分别为35.43%和72.87%；DOX包载量分别为14.9%和21.4%。利用透析法研究DOX:CS-NGs和DOX:CS/CMCS-NGs在连续的胃肠道模拟液中的释药行为，结果表明，在胃模拟液（pH1.2）中，DOX:CS-NGs的药物释放速率明显高于DOX:CS/CMCS-NGs，2h内，DOX:CS-NGs和DOX:CS/CMCS-NGs的药物累积释放率分别为32.4%和12.6%；随着释药介质依次改变为十二指肠模拟液（pH6.0，2h），空肠模拟液（pH7.0，2h），DOX:CS-NGs和DOX:CS/CMCS-NGs的药物释放速率较慢且大致相同，二者的药物累计释放率分别为，十二指肠模拟液：DOX:CS-NGs42.3%，DOX:CS/CMCS-NGs22.4%；空肠模拟液：DOX:CS-NGs61.2%，DOX:CS/CMCS-NGs38.7%，当释药介质改变为回肠/小肠上皮细胞间隙模拟液（pH7.4，2h）后，DOX:CS-NGs和DOX:CS/CMCS-NGs的释药速率加快，其终点药物累计释药率为87.6%和81.4%。以上结果表明，与DOX:CS-NGs相比，DOX:CS/CMCS-NGs能够有效降低药物在胃酸环境下的突释，将药物定向输送至小肠部位,在进入小肠上皮细胞间隙后释放药物。以小肠囊法分别研究了DOX:CS/CMCS-NGs和DOX:CS-NGs在大鼠不同肠段中的粘膜粘附性及通透，结果表明，DOX:CS/CMCS-NGs在十二指肠、空肠以及回肠部位能够有效促进相应肠段对DOX的粘附及吸收，其药物透过率和粘附率分别为DOX:CS-NGs的1-3.2倍和1.1–2.4倍。以传统静脉注射DOX作为对照，分别对小鼠进行口服DOX溶液、DOX:CS-NGs以及DOX:CS/CMCS-NGs，研究了四种剂型的药代动力学和组织分布，结果表明，DOX:CS/CMCS-NGs能够有效提高DOX的口服生物利用度，其绝对生物利用度为42%，是口服的6倍DOX，口服DOX:CS-NGs的1.75倍。口服DOX:CS/CMCS-NGs24h后，在小鼠的肝脏、脾脏、肺部仍可检测到DOX，且含量远高于其他三种剂型，表明DOX:CS/CMCS-NGs能够显著延长DOX在体内的循环时间。以小鼠为动物模型，通过分别在1d和15d两次给药的方式，研究了25天内静脉注射DOX、口服空白CS/CMCS-NGs以及口服DOX:CS/CMCS-NGs的对小鼠的心肾脏毒性，测量小鼠的体重以及心肾重量和生化指标，结果表明，与传统静脉注射DOX相比，口服DOX:CS/CMCS-NGs能够显著减小DOX的心肾毒性。利用Caco-2细胞对双荧光纳米凝胶（Cy3-CS/FITC-CMCS-NGs）的摄取和转运的方式和途径进行了定性和定量研究，结果表明，Caco-2细胞对Cy3-CS/FITC-CMCS-NGs的摄取和转运主要是一种主动运输，主要通过网格蛋白介导的内吞方式进行。分别研究了CS、CMCS以及CS/CMCS-NGs在不同pH值环境下对钙离子的螯合作用，结果表明，三种材料对钙离子的螯合能力随pH值的升高而加强，其对钙离子的螯合能力为CS/CMCS-NGs＞CMCS＞CS，表明CS/CMCS-NGs对钙离子具有的较高的螯合能力主要归因于纳米凝胶的3D结构中和CMCS组分。利用Caco-2致密单层构建小肠吸收模型，研究了DOX:CS/CMCS-NGs经细胞旁途径透粘膜的机理，结果表明，纳米凝胶的CS和CMCS组分均能够可逆性降低Caco-2致密单层的跨膜电阻（Transepithelialelectricalresistance,TEER），使药物经肠道通过细胞旁途径进入体循环，其中，CS降低TEER的幅度随pH的升高（pH6.6-pH7.4）而减小，而CMCS降低TEER的幅度随pH值的升高（pH6.6-pH7.4）而增大。向DOX:CS/CMCS-NGs中加入钙离子后，Caco-2的TEER的降低幅度显著减小，结合纳米凝胶及其组分对钙离子的螯合作用表明，DOX:CS/CMCS-NGs经细胞旁途径透粘膜作用归因于其CS和CMCS组分的协同作用，在弱酸性（pH＜7）条件下，即十二指肠环境中，DOX:CS/CMCS-NGs中质子化的CS组分能够打开细胞间紧密连接，同时，部分去质子化的CMCS组分能够螯合钙离子，打开细胞间粘合连接进而促进药物通过细胞旁途径进入体循环；在中性及弱碱性条件（pH≥7）下，即空肠和回肠环境中，CS组分去质子化，打开细胞间紧密连接的能力减弱，而完全去质子化的CMCS组分螯合钙离子能力增强，确保药物的持续吸收。采用离子交联结合滴注法和乳化法的方式以将DOX:CS/CMCS-NGs固定于多层海藻酸钙胶球（Multilayeralginatebead,M-ALG-Bead）中，得到载药纳米凝胶固定化多层球（NGs-M-ALG-Bead）,利用响应面分析的方法优化制备过程，结果表明，NGs-M-ALG-Bead对DOX的包封率与海藻酸钠的浓度、氯化钙浓度以及DOX:CS/CMCS-NGs浓度有关而与多层球的层数无关，当海藻酸钠的浓度为3.44%，氯化钙浓度为3.23%，DOX:CS/CMCS-NGs浓度为0.3%时，得到最高的药物包封率（97.21%）。不同层数的NGs-M-ALG-Bead的溶胀实验及NGs-M-ALG-Bead在连续胃肠道模拟液中的释药动力学表明，4层的NGs-M-ALG-Beads在胃酸环境下最稳定，其溶胀率和药物累计释放率分别5%和3.8%，有利于提高剂型在小肠部位处的有效浓度，而在小肠部位，随着海藻酸钠多层球的解体，完整的DOX:CS/CMCS-NGs被逐渐释放出来，有利于延长DOX:CS/CMCS-NGs与小肠上皮粘膜的接触时间，提高小肠对药物的吸收效果，离体小肠粘附性和通透性实验表明，NGs-M-ALG-Beads能够有效提高DOX:CS/CMCS-NGs的粘膜粘附率和药物通透率，分别为游离DOX:CS/CMCS-NGs的1.07-1.15倍和1.28-1.38倍。本文以壳聚糖及其水溶性衍生物羧甲基壳聚糖为原料，制备了一种壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米凝胶用于口服药物的输送。通过体外、体内实验评估了该材料的粘膜粘附性、通透性以及生物安全性并研究了其透粘膜机理。通过将该纳米凝胶固定于海藻酸钙多层球中，进一步提高了药物的输送效率，结果证明该纳米凝胶有望成为一种安全有效的药物口服输送载体。
【作者】冯超；
【导师】陈西广；
【作者基本信息】中国海洋大学，生物化学与分子生物学，2014，博士
【关键词】壳聚糖；羧甲基壳聚糖；纳米凝胶；口服药物输送；

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