基于脱细胞猪角膜基质的组织工程全层人角膜的体外重建、鉴定及其在动物移植中的作用研究

【摘要】角膜是位于眼表的透明组织，主要行使屈光的功能。由于角膜直接与外界环境接触，因此极易受到机械外伤、热灼伤以及微生物的感染，导致角膜病的发生，严重者甚至失明。角膜移植是唯一的治疗方法。但是，目前所需的供体角膜数量严重匮乏，远远不能满足临床的需要。随着角膜组织工程的兴起与发展，组织工程人角膜（Tissue-engineeredHumanCornea，TE-HC）有望成为捐献角膜的等效替代物，从而解决供体不足的问题，为角膜病盲患者带来复明的希望。TE-HC体外重建的核心要素主要包括两方面：一是能够获得足量的、形态结构及功能正常的人角膜种子细胞；二是制备出与种子细胞具有良好生物相容性的载体支架。目前用于TE-HC的种子细胞主要有胚胎干细胞（embryonicstemcell，ESC）、原代培养细胞、成体干细胞（adultstemcells,ASC）以及转染细胞系细胞；ESC应用引起的伦理问题、原代培养细胞的数量限制、ASC诱导分化率低以及转染细胞系细胞的潜在致瘤性风险，限制了这些细胞在角膜组织工程中的应用；载体支架主要有天然生物材料、天然高分子材料以及合成高分子材料。天然高分子材料构建的载体支架存在的机械性能缺陷、合成高分子材料的生物相容性较差限制了其作为组织工程角膜载体支架的应用。因此寻找理想的角膜种子细胞以及载体支架材料成为体外成功重建TE-HC的关键因素。本文采用的非转染、无致瘤性的HCEP（humancornealepithelium,HCEP）细胞、基质（humancornealstroma,HCS）细胞以及内皮（humancornealendothelium,HCE）细胞，具有角膜细胞的正常属性及功能，并且体外增殖能力强，短时间内即可获得大量的细胞，从而作为理想的种子细胞解决了TE-HC体外重建的种子细胞来源问题。而在载体支架方面，经本实验室前期的研究、探索及优化，制备出了具有透光率高、生物相容性好的脱细胞猪角膜基质（acellularporcinecornealstroma,aPCS），成为体外重建TE-HC的理想载体支架材料。为了进一步鉴定HCEP细胞、HCS细胞以及HCE细胞的属性、功能蛋白的表达以及是否具有潜在的致瘤性，本文对第70代的HCEP细胞、HCS细胞以及HCE细胞进行了复苏、扩增培养和鉴定。结果显示，复苏的第70代HCEP细胞和HCE细胞均呈典型上皮细胞型，而HCS细胞呈典型成纤维细胞型。HCEP细胞、HCE细胞的细胞与细胞之间紧密相靠、互相衔接，排列呈现“铺路石”状，具有连接成片的能力，而HCS细胞排列呈流线型。HCEP细胞、HCE细胞以及HCS细胞的群体倍增时间分别为39.6h、38.6h和36.5h，三种细胞的活力良好，增殖分裂旺盛，特征性染色体数目仍均为2n=46。功能蛋白的表达检测结果显示，HCEP细胞能够表达HCEP特异性标志蛋白—角蛋白3和12，以及钠钾泵和整联蛋白，表明该细胞仍具有角膜上皮的表型，且具有形成完整HCEP结构的潜能；HCS细胞能够表达HCS特异性标志蛋白—波形蛋白,以及乙醛酸脱氢酶ALDH3A1及整联蛋白，表明该细胞仍具有角膜基质细胞的潜能；而HCE细胞能够表达钠钾泵、紧密连接蛋白ZO-1及整联蛋白，表明该细胞仍具有角膜内皮的表型，且具有形成完整HCE结构的潜能。致瘤性检验结果显示，这三种角膜种子细胞安全性好，均无致瘤性。因此，HCEP细胞、HCS细胞以及HCE细胞可作为体外重建TE-HC的理想种子细胞。为了获得理想的载体支架，本文以带后弹力层的猪角膜为研究材料，应用0.5%脱氧胆酸钠及0.04%原钒酸钠联合DNA-RNA酶对猪角膜进行脱细胞处理，通过风干的方法制备出理想的aPCS载体支架材料，并对其进行了形态功能鉴定和生物相容性研究。石蜡切片HE染色和冰冻切片DAPI染色结果显示，aPCS无任何细胞残留；阿利新兰染色结果显示胞外基质糖胺聚糖（GAG）的分布与对照相似；而扫描电镜结果显示aPCS后弹力层面及基质面光滑平整；透射电镜结果显示构成aPCS胶原板层的胶原纤维排列整齐规则。为了检测aPCS的生物相容性，我们制备了aPCS浸提液，并进行了浸提液对HCEP细胞、HCS细胞以及HCE细胞的细胞活力及细胞毒性的检测，结果显示aPCS浸提液对三种细胞的生长均无影响，不影响细胞的增殖，也不引起细胞的凋亡，没有对细胞产生毒性。因此，aPCS可以作为体外重建TE-HC的理想载体支架。为了建立TE-HC体外规模化重建的技术工艺条件，在获得了理想的种子细胞和载体支架材料后，我们进行了TE-HC的体外重建研究。首先采用微量注射的方法将HCS细胞接种于aPCS支架的基质中，然后将其置于含10%胎牛血清（fetalbovineserum,FBS）的DMEM/F12（1:1）培养液中，培养24h；其次，将接种过HCS细胞的植片放于插入式培养皿中，后弹力层面朝上，将HCE细胞接种于aPCS的后弹力层面，培养24h后反转植片，后弹力层朝下，接种HCEP细胞，采用气-液界面培养方法持续培养5d，从而重建出了TE-HC，并对其形态结构及细胞功能蛋白表达进行了鉴定。茜素红染色结果显示HCE细胞在后弹力层面形成了连续的细胞单层；石蜡切片HE染色结果显示aPCS支架内基质细胞伸展良好，与支架材料结合紧密；而HCEP细胞在aPCS支架基质层表面形成了6-7层的复层上皮结构，类似于正常角膜的结构；免疫组化染色结果显示TE-HC的HCEP细胞、HCS细胞以及HCE细胞的标志性蛋白、功能蛋白表达均呈阳性，与正常细胞的表型和功能相同。上述结果表明以带后弹力层的aPCS为载体支架、以第70代HCEP细胞、HCS细胞以及HCE细胞为种子细胞体外成功重建出了TE-HC，具有与活体角膜相似的组织结构，其种子细胞具有功能蛋白的阳性表达，表明可能具有全角膜的生物学功能。为了鉴定体外重建TE-HC的生物学功能，本文选用新西兰兔和比格犬进行了TE-HC的穿透性角膜移植实验，并通过过裂隙灯显微镜观察、角膜厚度以及眼压测定等方法来评估在体TE-HC的透明度、厚度和新生血管等特征。结果显示，新西兰兔术后前10d，角膜水肿，眼压偏高；第20d，水肿状况减轻，眼压恢复正常；第30d，角膜部分透明。比格犬移植实验结果显示，在术后前期，植片水肿，眼压升高，但是30d后，角膜重新上皮化，眼压恢复正常，角膜水肿减轻，但是还是未恢复到正常角膜厚度，目前我们已观察至270d，发现角膜新生血管情况好转，但是术眼角膜厚度还是高于正常角膜。综上所述，本文以具有正常属性和功能的第70代HCEP细胞、HCS细胞以及HCE细胞为种子细胞，以具有良好生物相容性的aPCS为载体支架，体外重建了形态结构和功能属性与活体角膜相似的TE-HC，并进行了新西兰兔和比格犬的穿透性角膜移植实验，虽然在体动物实验结果没有达到我们预想的理想情况，但是却为我们提供了后续TE-HC重建的参数，在此基础上，接下来我们将对TE-HC的重建方法进行进一步优化，从而最终能够实现成功重建出可应用于临床角膜移植的TE-HC。
【作者】刁金美；
【导师】樊廷俊；
【作者基本信息】中国海洋大学，细胞生物学，2014，博士
【关键词】人角膜细胞；脱细胞猪角膜基质；生物相容性；组织工程全层人角膜；穿透性角膜移植；

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