呋喃丹和百菌清对斑马鱼酪氨酸转氨酶表达调控的影响及其机制研究

【摘要】农药对生物体细胞糖类、蛋白质和脂质的代谢均能产生毒性效应，可通过改变下丘脑-垂体-肾上腺轴激素、激活自主神经系统、细胞因子和神经内分泌免疫轴激素的水平使机体进入应激状态。酪氨酸转氨酶(TAT，EC2.6.1.5)广泛存在于生物体中，是酪氨酸降解过程的限速酶，参与糖异生过程。TAT转录受多种糖代谢相关激素调控，糖皮质激素和胰高血糖素可诱导TAT的表达，而胰岛素则抑制TAT的转录激活。TAT作为糖皮质激素等的靶基因和糖异生的关键酶，农药暴露可能对TAT的表达调控产生影响，从而影响机体糖代谢水平。本文以斑马鱼(Daniorerio)为研究对象，克隆获得到了斑马鱼TAT基因的cDNA全长序列，根据对某地市场蔬菜长达一年的农药残留监测结果，选择有检出的呋喃丹和百菌清进行斑马鱼暴露试验，研究其对TAT的mRNA、蛋白和酶活性水平以及转录调控的影响，以探讨农药对斑马鱼TAT表达调控的作用及其对糖代谢的影响。(1)本文首先利用RT-PCR和RACE技术获得到了斑马鱼TAT基因的cDNA全长序列(2049bp)，其开放阅读框(1407bp)可编码468个氨基酸的蛋白(分子量为51.7kDa)。通过该蛋白序列与已知的17个物种的TAT蛋白比对分析，发现与其它硬骨鱼TAT蛋白序列的相似性最高，达到76.6-86.0%。利用PHYLIP3.5c软件包NJ法构建了系统进化树，该蛋白序列与鱼类TAT聚在一起，符合同分支物种蛋白聚在一起的规律。采用Real-timePCR技术进行时空表达分析，发现斑马鱼TAT主要在肝脏中表达，仔鱼孵化后的转录活性显著增强。与哺乳动物相似的时空表达特征说明斑马鱼TAT可能具有与哺乳动物TAT相似的功能。(2)本文对某地市场在售蔬菜进行了1年的农药残留监测，共检测样品2983个，发现呋喃丹从0.0066μg·kg-1至8.5914μg·kg-1均有检出，百菌清从0.0127μg·kg-1至63.4543μg·kg-1均有检出，表明这2种农药在农业生产中正在使用。目前，关于这2种农药对TAT表达调控影响的研究较少。因此，本文选择这2种农药用于斑马鱼毒性暴露实验。将斑马鱼暴露于10、30、50、100、200、500μg·L-1的呋喃丹中4h，30μg·L-1以上暴露组即可检测到TATmRNA表达量显著降低，并呈现剂量效应关系；50μg·L-1呋喃丹中暴露1、2、4、8、12、24h，TATmRNA表达量4h即显著降低，呈现时间效应关系。暴露在5、7.5、10、15、20、30μg·L-1的百菌清中8h，浓度达到10μg·L-1以上即可检测到TATmRNA表达量显著降低，但没有剂量效应关系；采用15μg·L-1百菌清中暴露2、4、6、8、12、24h，TATmRNA表达量在8h开始显著降低，也未呈现时间效应关系。将斑马鱼暴露在浓度为50μg·L-1的呋喃丹中4h或15μg·L-1的百菌清中8h，通过Westernblot和酶活性测定发现单位肝重TAT蛋白表达量和TAT酶活性均比对照组显著降低，降幅均在50%左右。研究结果表明呋喃丹和百菌清均可显著抑制斑马鱼肝脏TAT的转录活性，由于TAT转录受到抑制导致蛋白含量和TAT的酶活性显著降低。(3)本文检测了生长激素(GH)和甲状腺激素T4对斑马鱼TAT表达的影响。通过实时定量PCR技术证实GH及T4能够刺激斑马鱼TAT的表达，克隆获得了斑马鱼TAT基因的启动子序列(1575bp)，分析发现存在3个潜在的STAT5结合位点，推测GH可能是通过STAT5结合位点调控斑马鱼肝脏TAT的表达。研究了呋喃丹和百菌清对斑马鱼GH、T4以及糖代谢相关激素的影响，并观察了血糖、肝糖原水平以及乙酰胆碱酯酶（AChE）活性的变化。将斑马鱼暴露在浓度为50μg·L-1的呋喃丹中4h或15μg·L-1的百菌清中8h后，皮质醇含量显著降低，胰岛素和胰高血糖素水平均升高，呋喃丹导致GH和T4显著上升，而百菌清对二者无显著影响；斑马鱼肝糖原含量显著下降，而血糖未出现显著变化；斑马鱼AChE活性未受到显著抑制。可见农药暴露降低了糖皮质激素水平，提高了胰岛素的水平，这可能是导致TATmRNA转录下调的主要原因，并导致TAT蛋白含量和酶活性的显著降低，使糖异生过程受到抑制，但并未影响血糖水平。
【作者】赵海峰；
【导师】汝少国；王蔚；
【作者基本信息】中国海洋大学，生态学，2014，博士
【关键词】斑马鱼；酪氨酸转氨酶；呋喃丹；百菌清；糖皮质激素；

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