中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）抗白斑综合征病毒（WSSV）候选基因分析

【摘要】中国对虾是我国主要的经济水产养殖品种，二十世纪九十年代白斑综合征病毒（whitespotsyndromevirus,WSSV）暴发以来其产业受到严重影响。近年来随着种苗和养殖水平整体的提高，我国对虾养殖业逐年发展。但时至今日，WSSV依旧是影响对虾养殖业的主要病原之一。从根本上解决对虾养殖业中WSSV等问题的关键是选育出抗病能力强和生长速度快等优良性状兼顾的中国对虾新品种。对于阈性状和低遗传力性状，将传统选育手段和先进的分子生物学技术相结合，能提高选择准确性，加快育种进程。本研究以中国对虾“黄海2号”454转录组测序数据为基础，以RACE、基因克隆、常规测序、HRM、ELISA、real-timePCR等常规生物学技术为平台，进行中国对虾抗WSSV性状候选基因和SNP分析，为中国对虾抗WSSV育种提供理论依据和实践材料。主要研究包括首次获得中国对虾MEK、ERK、Ras和组织蛋白酶B基因序列；开发、分析各基因内SNP位点；进行正常中国对虾和感染WSSV的中国对虾不同组织内各基因表达水平分析；感染中国对虾WSSV复制特点以及抑制中国对虾MEK/ERK信号转导通路对WSSV复制水平影响；挑选454转录组测序中的候选SNP位点；利用HRM技术在抗病组和敏感组内进行基因分型，统计遗传多态性信息和进行抗病关联分析等。具体内容包括：1、报道了中国对虾MEK（FcMEK）mRNA序列（序列上传至GenBank，登录号为KJ135020）并发现该基因表达受WSSV感染的影响。感染WSSV的中国对虾，FcMEKmRNA在肝胰腺中6h和48h呈现上调表达，12h和24h转录水平下降。FcMEKmRNA在鳃中12h、24h和48h转录水平上升，6h转录水平下降。FcMEKmRNA在肌肉中6h、12h、24h和48h转录水平上升。结果提示FcMEK表达受WSSV感染影响。通过常规测序技术在FcMEKmRNAORF内发现三个SNP位点，分别位于ORF的第762bp、765bp和972bp处。三个SNP突变位点都是C/T转换，分别命名为C-762T、C-765T和C-972T。结果表明C-762T和C-765T位点位于同一个单倍型。利用HRM技术进一步对中国对虾抗病组和敏感组内上述三个SNP位点进行基因分型，C-762T和C-765T突变位点得到可读峰图，提示附近没有内含子存在。抗病组内C-762T和C-765T突变位点Ho为0.604，He为0.424，MAF为0.302。敏感组内C-762T和C-765T突变位点Ho为0.583，He为0.424，MAF为0.302。C-762T和C-765T突变位点在两组内都偏离HWE，但进一步的抗病组和敏感组卡方检验结果表明，两个组间的基因型分布没有显著差异。偏离HWE提示在整个中国对虾“黄海2号”选育群体中该位点有可能受到了选择。2、报道了中国对虾ERK（FcERK）mRNA序列（序列上传至GenBank，登录号为KC537791）并发现该基因表达受WSSV感染的影响。感染WSSV的中国对虾，FcERKmRNA在肝胰腺中6h、12h、24h和48h转录水平下降。FcERKmRNA在鳃中6h、12h和24h转录水平上升，48h转录水平下降。FcERKmRNA在肌肉中48h转录水平上升，6至24h呈现小幅波动变化趋势。肝胰腺中FcERK蛋白从3h到24h呈现缓慢升高趋势，至48h下降。3h、12h和48h鳃中FcERK蛋白水平上升，在6h和24h下降。12h和48h肌肉中FcERK蛋白水平上升，3h、6h和24h下降。感染WSSV后FcERK表达水平的变化提示其受到WSSV感染过程影响。在FcERKmRNAORF内发现一个SNP位点，在3’UTR内发现一个SNP位点，都是C/T转换，分别命名为C-544T、C-1133。利用HRM技术对中国对虾抗病组和敏感组内上述两个SNP位点进行基因分型，抗病组内C-544T突变位点Ho为0.146，He为0.154，MAF为0.083。敏感组内C-544T突变位点Ho为0.208，He为0.204，MAF为0.115。抗病组内C-1133T突变位点Ho为0.177，He为0.162，MAF为0.089。敏感组内C-1133T突变位点Ho为0.156，He为0.145，MAF为0.078。两个SNP位点在两组内都符合HWE，且两组间基因型分布没有显著差异，虽然本研究结果提示FcERK可能参与中国对虾抗WSSV过程，但基因内两个突变位点并没有影响FcERK在抗WSSV过程中的作用。上述两个SNP位点的MAF都远大于0.05，适合进行关联分析，作为信号转导通路中的重要激酶，FcERK内SNP位点值得深入研究。3、本研究发现感染WSSV后死亡的中国对虾，后期死亡个体病毒含量高于早期死亡个体，提示对虾抗WSSV性能从一方面体现在耐受病毒数量上，因此以育种目的来讲，除了能耐受更多病毒的感染，抑制病毒复制速度，甚至是杀灭病毒的能力，是对虾能最终存活下来的关键，另外研发新药物来抑制宿主体内病毒复制能力也能提高染病对虾存活率。利用MEK的特异抑制剂U0126抑制中国对虾MEK/ERK通路活性后，检测感染宿主的WSSV复制水平。与对照组相比，添加U0126的实验组中WSSV复制水平受到抑制，24h实验组WSSV复制水平约为对照组的五分之二；48h实验组WSSV复制水平约为对照组的五分之三。综合本研究中对于FcMEK和FcERK基因在感染WSSV的中国对虾不同组织内表达变化的研究结果，提示WSSV在感染中国对虾时需挟持宿主MEK/ERK通路用于其自身复制。4、报道了中国对虾Ras基因（FcRas）mRNA序列（序列上传至GenBank，登录号KC522602）并发现该基因表达受WSSV感染的影响。感染WSSV的中国对虾，FcRasmRNA在肝胰腺中6h和48h转录水平上升，12h和24h转录水平下降。FcRasmRNA在鳃和肌肉组织中6h、12h、24h和48h都呈上调表达。感染WSSV后转录水平的明显变化提示FcRas受到WSSV感染的影响。对26只中国对虾FcRasmRNA测序结果中未发现SNP位点，是本文所研究的五个基因中唯一一个没有发现SNP位点的基因，从一个方面也提示Ras基因高度保守性的特点。5、报道了中国对虾组织蛋白酶B（FcCathepsinB）mRNA序列（序列上传至GenBank，登录号为KC537790）并发现该基因表达受WSSV感染的影响。感染WSSV的中国对虾，FcCathepsinBmRNA在肝胰腺中6h和48h转录水平上升，12h和24h转录水平下降。FcCathepsinBmRNA在鳃中6h、12h和24h转录水平上升，48h转录水平下降。FcCathepsinBmRNA在肌肉中6h、12h和48h转录水平上升，24h略微下降。感染WSSV后转录水平的明显变化提示其受到WSSV感染过程影响。在FcCathepsinBORF内发现三个SNP，分别位于ORF第42bp、756bp和984bp，三个SNP位点都是C/T转换，并命名为C-42T、C-756T和C-984T。结果表明该三个SNP位于同一个单倍型。利用HRM技术进一步对抗病组和敏感组进行SNP基因分型，C-984T突变位点处有可读峰图，提示其周围没有内含子存在。抗病组中C-984T突变位点的Ho为0.375，He为0.344，MAF为0.219。敏感组中C-984T突变位点的Ho为0.417，He为0.355，MAF为0.229。该SNP位点在两组内都符合HWE，且基因型分布没有显著差异，说明该SNP位点并没有影响基因在抗WSSV过程中的作用。上述SNP的MAF远大于0.05，适合进行关联分析。6、利用HRM技术对中国对虾“黄海2号”454转录组测序中的候选SNP位点进行验证和分析，81个SNP位点得以确认，且发现1个抗病相关位点。本研究挑选480个候选SNP位点，设计相应HRM引物480对，经验证其中合格引物243对。设计相应非标计探针，通过HRM实验对中国对虾抗病组和敏感组进行基因分型，共有81个位点确认为SNP，并统计Ho、He、Ne、MAF、I、HWE信息。81个SNP位点在抗病组中有55个位点MAF大于0.05，在敏感组中有56个位点MAF大于0.05，这些SNP位点的多态性较高，适合进行关联分析。81个SNP位点在抗病组中有65个符合HWE，敏感组中有60个符合HWE。在81个SNP位点中，A/C突变4个，A/G突变27个，A/T突变11个，C/G突变9个，C/T突变28个，T/G突变2个，转换/颠换=2.115，符合“transitionbias”原理。通过关联分析发现312C1298-154C/T突变位点的C/C基因型在2011年和2012年抗病组和敏感组中都差异分布，提示该位点与抗WSSV性状相关。通过基因克隆技术获得该抗病相关SNP位点所在基因，为磷酸丙酮酸水合酶，命名为FcPH（序列上传至GenBank，登录号KJ649284）。FcPHmRNAORF长1305bp，编码434氨基酸。利用real-timePCR检测该基因表达水平在感染WSSV的中国对虾鳃和肌肉中都有明显升高。结果提示磷酸丙酮酸水合酶受到WSSV感染过程影响，该基因内所发现的SNP位点与抗WSSV性状相关。
【作者】李旭鹏；
【导师】孔杰；
【作者基本信息】中国海洋大学，海洋生物学，2014，博士
【关键词】中国对虾；WSSV；基因克隆；转录组；SNP；

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