大菱鲆幼鱼几种功能性氨基酸营养代谢的研究

【摘要】以我国北方重要经济海水养殖鱼类大菱鲆（ScophthalmusmaximusL.）为研究对象，在室内循环水养殖系统中进行摄食生长实验，研究饲料中精氨酸和谷氨酰胺水平对大菱鲆幼鱼生长、免疫及精氨酸代谢的影响；研究饲料中支链氨基酸水平对大菱鲆幼鱼生长和饲料利用的影响，并从分子层面探讨支链氨基酸代谢的调控机制；研究高植物蛋白饲料中添加羟脯氨酸和脯氨酸对大菱鲆幼鱼生长和胶原蛋白代谢的影响。本文研究内容和主要研究结果如下：1.饲料中精氨酸和谷氨酰胺水平对大菱鲆幼鱼生长、非特异性免疫力、疾病抵抗力及精氨酸代谢的影响本实验旨在研究饲料中精氨酸（Arg）和谷氨酰胺（Gln）水平对大菱鲆幼鱼生长、非特异性免疫力、疾病抵抗力及精氨酸代谢的影响。以白鱼粉（23%）、豆粕（16%）和玉米蛋白粉（23%）为主要蛋白源配制出粗蛋白含量50%、粗脂肪含量12%的基础饲料，在基础饲料中分别添加不同梯度的Ar（g0.0、1.0和2.0%）和Gln（0.0、1.0和2.0%），配制出9组等氮等脂的实验饲料。在室内循环水系统中进行摄食生长实验，每个处理设3个重复，每个重复放养35尾鱼，每天定量投喂2次，养殖周期12周。养殖实验结束后，以爱德华氏菌感染实验鱼，并记录感染7d后的存活率。结果表明，饲料中Arg和Gln水平对大菱鲆幼鱼生长性能未产生显著影响，但在未添加Gln处理组，存活率随饲料中Arg水平的升高而显著升高（P<0.05）。总体上，头肾呼吸爆发活力、血清溶菌酶和谷胱甘肽过氧化物酶活力均随饲料中Arg和/或Gln水平升高而显著升高（P<0.05）。感染爱德华氏菌后，存活率随饲料中Arg水平升高而显著升高（P<0.05），但Gln添加对其并未产生显著影响且与Arg之间不存在交互作用（P>0.05）。饲料中Arg和Gln水平显著影响了血清和肝脏中诱导型一氧化氮合成酶活力（P<0.05）。肝脏中Arg酶I基因表达随饲料中Arg和Gln水平升高而显著升高，且Arg和Gln之间存在显著交互作用（P<0.05）。综上结果，饲料中Arg和Gln水平升高显著提高了大菱鲆幼鱼非特异性免疫力，且饲料中Arg水平的升高显著提高了疾病抵抗力。同时，饲料中Arg和Gln能够调控NO合成和Arg代谢。2.饲料中支链氨基酸水平对大菱鲆幼鱼生长、饲料利用和TOR信号通路相关基因表达的影响在饲料中添加不同水平亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）和缬氨酸（Val），研究其对大菱鲆幼鱼（初重4.64±0.004g）生长、饲料利用和TOR信号通路相关基因表达的影响。以白鱼粉（22%）、虾壳粉（11%）和花生粕（26%）为主要蛋白源，鱼油为主要脂肪源，采用3×3双因子实验设计，Leu添加水平分别为0.0、1.0和2.0%，异亮氨酸（Ile）和缬氨酸（Val）以3：4比例作为一个整体（命名为Ile+Val），添加水平分别为0.0、1.4和2.8%，配制出9组等氮（50%粗蛋白）等脂（12%粗脂肪）实验饲料，实验在室内循环水系统中进行，每个处理3个重复，每个重复放养35尾鱼，每天饱食投喂2次，养殖周期为10周。结果表明，在较低Ile+Val添加水平时（0.0和1.4%），添加适中的Leu（1.0%）显著提高了大菱鲆幼鱼的特定生长率（SGR），添加过高的Leu（2.0%）反而降低了SGR（P<0.05），但在高Ile+Val添加水平时（2.8%），Leu水平未对SGR产生显著影响（P>0.05）。另外，在适中Leu添加水平（1.0%）时，随Ile+Val添加水平升高，SGR显著降低（P<0.05）。饲料中Leu水平显著影响了大菱鲆幼鱼的饲料效率（FER）和蛋白质效率（PER），且与Ile+Val之间存在显著交互作用（P<0.05）。当饲料中Leu和Ile+Val添加水平分别为1.0和0.0%时，FER和PER达到最大值并显著高于其他处理组（P<0.05）。同时，饲料中适宜Leu与Ile+Val水平显著提高了大菱鲆幼鱼对饲料干物质和粗蛋白的表观消化率（P<0.05），且两者之间存在显著交互作用（P<0.05）。对TOR信号通路相关基因表达分析显示，饲料中Leu与Ile+Val水平对大菱鲆幼鱼肝脏和肌肉中TOR和4E-BP1基因表达未产生显著影响（P>0.05）。饲料中Leu和/或Ile+Val水平升高提高了大菱鲆肝脏中4E-BP2基因表达（P<0.05），但对肌肉中4E-BP2基因表达未产生显著影响（P>0.05）。综上结果，饲料中添加1.0%Leu和0.0%Ile+Val能够促进大菱鲆幼鱼生长和饲料利用，但当Leu与Ile+Val比例不平衡时，会对生长和饲料利用产生抑制作用。饲料中BCAA水平对TOR、4E-BP1和4E-BP2基因（肝脏4E-BP2基因除外）表达未产生显著影响。3.大菱鲆支链酮酸脱氢酶激酶基因克隆、序列分析及饲料中BCAA水平对其mRNA表达量的影响本实验以大菱鲆（ScophthalmusmaximusL.）为研究对象，采用同源克隆技术和RACE技术从大菱鲆肝脏中成功克隆得到支链酮酸脱氢酶激酶（BCKDK）基因cDNA全序列1713bp（Genbank登录号：KJ489027），其中开放阅读框1314bp，编码437个氨基酸，预测分子量约为4.8831kDa，理论等电点9.19。BLAST分析显示大菱鲆BCKDK基因与其它脊椎动物该基因具有较高相似度。与其他脊椎动物BCKDK基因构建系统发生树，发现其基因系统发育树与形态学分类具有较好的相关性。采用实时定量PCR技术检测饲料中BCAA水平对大菱鲆肝脏和肌肉中BCKDK基因mRNA表达量的影响。结果表明，饲料中Leu和Ile+Val水平升高显著降低了大菱鲆幼鱼肝脏中BCKDK基因mRNA水平（P<0.05），但两者之间未发现显著交互作用（P>0.05）。饲料中Leu水平升高显著降低了大菱鲆肌肉中BCKDK基因表达（P<0.05），且与Ile+Val之间存在显著交互作用（P<0.05）。该研究结果表明，饲料中BCAA的拮抗作用可能与激活的BCAA氧化代谢有关。4.高植物蛋白饲料中添加L-羟脯氨酸对大菱鲆幼鱼生长、组织羟脯氨酸和胶原蛋白含量及脯氨酰4-羟化酶α(I)基因表达的影响在高植物蛋白饲料中添加L-羟脯氨酸（L-Hyp），研究其对大菱鲆幼鱼（初重8.11±0.01g）摄食、生长、饲料利用、组织Hyp和胶原蛋白含量及脯氨酰4-羟化酶α(I)（P4Hα(I)）基因表达的影响。以白鱼粉（15%）、豆粕（40%）和谷朊粉（14%）为主要蛋白源，分别在饲料中添加0.00、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25和1.50%的L-Hyp，配制出7种等氮（50%粗蛋白）等脂（12%粗脂肪）的实验饲料（Hyp实测值分别为0.12、0.33、0.51、0.60、0.80、1.03和1.23%）。实验在室内循环水系统中进行，每个处理设4个重复，每个重复放养35尾鱼，每天饱食投喂2次，养殖周期10周。结果表明，饲料中Hyp水平对大菱鲆幼鱼生长性能和饲料利用均无显著影响（P>0.05）。血浆游离Hyp、肝脏和肌肉总Hyp含量随饲料中Hyp含量升高而显著升高（P<0.05）。当饲料中Hyp含量达到或超过0.60%时，大菱鲆血浆游离Hyp含量显著高于其它处理组组（P<0.05）。1.03和1.23%Hyp组肝脏中总Hyp含量显著高于0.12和0.33%Hyp组（P<0.05）。当饲料中Hyp含量达到或超过0.60%时，大菱鲆肌肉中总Hyp和胶原蛋白含量也显著高于其它处理组（P<0.05），并在1.23%Hyp组达到最大值且显著高于其他处理组（P<0.05）。但脊柱总Hyp和胶原蛋白含量不受饲料中Hyp水平的影响（P>0.05）。肝脏P4Hα(I)基因表达在各处理组间无显著差异（P>0.05），但肌肉P4Hα(I)基因在高Hyp组的表达水平显著低于对照组（P<0.05）。综上结果，在高植物蛋白饲料中添加L-Hyp对大菱鲆幼鱼生长性能未产生促进作用，但显著提高了组织Hyp和肌肉总胶原蛋白含量。虽然饲料中Hyp水平升高未对肝脏中P4Hα(I)基因表达产生显著影响，但显著降低了肌肉中P4Hα(I)基因表达。5.饲料中脯氨酸和羟脯氨酸水平对大菱鲆幼鱼胶原蛋白合成和P4Hα(I)基因表达的影响本实验旨在研究在含高植物蛋白饲料中添加脯氨酸或同时添加脯氨酸和羟脯氨酸对大菱鲆幼鱼（初重8.12±0.01g）生长性能、组织羟脯氨酸和胶原蛋白含量及P4Hα(I)基因表达的影响。实验基础饲料（对照组）中粗蛋白和粗脂肪含量分别为50%和12%，在基础饲料中添加0.75%脯氨酸（Pro-0.75组）或同时添加0.75%脯氨酸和0.75%羟脯氨酸（Pro+Hyp组），配制出3组等氮等脂的实验饲料。实验在室内循环水系统中进行，每个处理设4个重复，每个重复放养35尾鱼，每天饱食投喂2次，养殖周期10周。实验结果表明，饲料中添加脯氨酸和羟脯氨酸对大菱鲆幼鱼生长性能和饲料利用均无显著影响（P>0.05），但肌肉中总羟脯氨酸和胶原蛋白含量随饲料中脯氨酸和羟脯氨酸水平升高而显著升高（P<0.05），并且Pro+Hyp组大菱鲆血浆中游离羟脯氨酸含量显著高于其他处理组（P<0.05）。Pro-0.75组大菱鲆肝脏和肌肉中P4Hα(I)基因表达水平最高且显著高于对照组（P<0.05），但Pro+Hyp组肌肉中P4Hα(I)基因表达水平显著低于Pro-0.75组（P<0.05）。综上结果，本实验条件下，高植物蛋白饲料中添加脯氨酸和羟脯氨酸对大菱鲆幼鱼生长性能无显著影响，但显著提高了肌肉中总胶原蛋白含量。
【作者】张凯凯；
【导师】艾庆辉；
【作者基本信息】中国海洋大学，水产养殖，2014，博士
【关键词】大菱鲆；精氨酸；谷氨酰胺；支链氨基酸；羟脯氨酸；脯氨酸；生长；代谢；

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