中国对虾感染白斑症病毒（WSSV）后血细胞差异表达蛋白质的鉴定及其特性分析

【摘要】病毒感染会激发宿主的免疫应答反应，宿主细胞内的一些因子在这一过程中起着重要的作用，其表达量通常会发生上调或下调的表达变化。白斑症病毒（WSSV）病是危害对虾养殖业健康发展的最重要疾病之一，中国对虾(Fenneropenaeuschinensis)对其极其易感，为寻找在中国对虾应答WSSV感染反应中起关键作用的蛋白，本文利用蛋白质组学技术鉴定了中国对虾感染WSSV后血细胞中发生差异表达的蛋白质，并对其中的2种蛋白—小泛素相关修饰物（SUMO）和蛋白磷酸酶进行了深入分析，为揭示对虾抗WSSV反应的分子机制提供了重要数据，具体研究内容和结果如下：（1）中国对虾感染WSSV后血细胞差异表达蛋白质的鉴定。双向（2D）电泳分离感染组和对照组对虾血细胞样品，并用PDQuest软件分析2D凝胶。结果成功获得了中国对虾血细胞总蛋白2D图谱，每张凝胶上有约580个蛋白质点被检测出；WSSV感染24后，共有26个蛋白质点呈显著性上调表达（P﹤0.05），19个蛋白质点呈显著性下调表达。随后，对差异表达蛋白质进行质谱分析，共有33种蛋白质得到了成功的鉴定，包括SUMO1、细胞质MnSOD、微管蛋白α1链、微管-肌动蛋白交联因子1、磷酸丙糖异构酶、核受体E75蛋白、空泡ATP合酶亚基BL、肌醇1,4,5-三磷酸受体和精氨酸激酶等；利用生物信息学方法将鉴定的蛋白进行GO功能分类，结果将其分为9个类群，分别为：免疫相关蛋白、刺激应答蛋白、细胞骨架蛋白、DNA或蛋白质结合蛋白、葡萄糖代谢相关蛋白、甾类激素介导的信号转导蛋白、ATP合酶、跨膜转运蛋白和未分组蛋白。此外，利用实时荧光定量PCR检测WSSV感染后对虾血细胞中3种上调表达蛋白（细胞质MnSOD、热休克蛋白70和精氨酸激酶）和1种下调表达蛋白（酚氧化酶原）对应基因的表达变化情况，结果显示，这些因子在mRNA水平的变化与蛋白质组学结果较为一致。（2）中国对虾SUMO及其E2结合酶UBC9的基因克隆与表达分析。从鉴定出的差异表达蛋白质中选取SUMO进行深入分析，首先，采用RACE技术对中国对虾SUMO和UBC9进行基因克隆，结果显示，中国对虾SUMOcDNA全长1128bp，包含一个282bp的开放阅读框（ORF），编码93个氨基酸，其理论分子量为10.6kDa；UBC9cDNA全长1170bp，包含一个483bp的ORF，编码160个氨基酸，其理论分子量为18.4kDa;同源性比对发现，中国对虾的SUMO和UBC9均高度保守。随后，利用实时荧光定量PCR分别检测了SUMO和UBC9mRNA的组织分布情况和在WSSV感染后的表达变化情况，结果显示，SUMO和UBC9基因在健康中国对虾各组织中均有表达，但表达水平不同，二者均在血细胞和性腺中呈高丰度表达；WSSV感染后，对虾血细胞和性腺中这2种基因均呈显著性上调表达，且血细胞中的上调表达更为显著。（3）中国对虾SUMOORF和UBC9ORF的原核表达及多克隆抗体制备及应用。利用大肠杆菌系统成功地构建了中国对虾SUMOORF和UBC9ORF的重组表达质粒，pET-28a-SUMO和pET-28a-UBC9，诱导表达后得到分子量分别为19.7kDa和25.6kDa的重组蛋白，并对目的蛋白进行了纯化；用纯化蛋白免疫小鼠，分别获得了抗SUMO和UBC9的多克隆抗体（PAb）。应用PAb分析中国对虾血细胞中SUMO和UBC9的特性，westernblotting结果显示，SUMO的PAb可以特异性识别血细胞中13.5kDa的蛋白，而UBC9的Pab可以识别18.7kDa的蛋白；间接免疫荧光实验结果表明，SUMO分布于血细胞的细胞核和细胞质中，而UBC9主要分布于细胞核中。（4）RNA干扰实验分析SUMO和UBC9在病毒感染中的作用。利用体外转录法，分别合成了SUMO和UBC9的双链RNA（dsRNA），dsSUMO和dsUBC9。随后，将dsRNA注射到对虾体内以研究SUMO或UBC9基因沉默对WSSV感染的影响。结果显示，病毒感染后，RNA干扰组对虾血细胞中的WSSV拷贝数和病毒基因的表达量均较阳性对照组低；累计死亡率曲线显示，SUMO或UBC9的沉默均在一定程度上降低了WSSV感染引起的对虾的死亡。（5）中国对虾蛋白磷酸酶1催化亚基β（PP1β）的基因克隆及原核表达。首先，采用RACE技术对中国对虾PP1β进行基因克隆和生物信息学分析，结果显示，PP1βcDNA全长1214bp，包含一个987bp的ORF，编码328个氨基酸，其理论分子量为37.6kDa；同源性比对发现，中国对虾的PP1β氨基酸序列表现出高度保守性。随后，利用实时荧光定量PCR检测了PP1βmRNA的组织分布情况和在WSSV感染后的表达变化情况，结果显示，PP1β在健康中国对虾各组织中均有表达，但表达水平不同，其中在性腺中表达最高，血细胞次之；WSSV感染后，对虾血细胞和性腺中PP1β基因均呈上调表达，并在12h达到峰值，且血细胞中的上调表达更为显著。此外，利用大肠杆菌系统成功地构建了中国对虾PP1βORF的重组质粒pET-28a-PP1β，诱导表达后得到分子量为41kDa的重组蛋白，并对目的蛋白进行了纯化。
【作者】李微；
【导师】战文斌；
【作者基本信息】中国海洋大学，水产养殖，2014，博士
【关键词】中国对虾；蛋白质组学；WSSV；血细胞；类泛素化；蛋白磷酸酶；

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