Isolation,Selection and Identification of Antagonistic Marine Bacteria and Safety Assessment for Their Potential Application as Probiotics

【摘要】随着细菌耐药性现象的日益严峻，越来越多的科学家致力于开发能够取代抗生素的抑菌剂。在生存竞争压力下，海洋细菌普通具有抗菌性，这也揭示了利用海洋细菌开发抗菌物质的策略。在本研究中分离得到272株海洋细菌，有136株细菌至少对李斯特菌，霍乱弧菌，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌中的一种致病菌具有抑菌效果。其中，2株分离得到的细菌能够抑制4种致病菌的生长，通过16srDNA分析确定它们分别为耐盐短杆菌DK1-SA11和卡那罗弧菌DK6-SH8。测定这两株细菌的抑菌活性和稳定性，结果表明，与DK6-SH8相比，DK1-SA11具有更宽的抑菌谱，能够裂解包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和白色念珠菌在内的致病菌，并且在高温和pH2~11范围内的都具有稳定的抑菌活性通过API鉴定系统、DNArecA、gyrA和gyrB基因序列分析，对DK1-SA11菌种进行生化和分子鉴定。API20E,APICORENY,API50CHB和APIZYM的API试剂盒生化鉴定结果和DNArecA,gyrA和gyrB基因的系统进化分析得知DK1-SA11为一株新菌株，不属于短杆菌属。利用序列分析发现DK1-SA11菌株与枯草芽孢杆菌斯皮兹仁亚种相应核苷酸序列具有很高的同源性，其序列相似性为96~99.9%。测定DK1-SA11菌株的益生特性、安全性和耐受量，利用APIZYM鉴定方法检测到该菌株能够生成一定量的碱性磷酸酶,esterase酯酶(C-4)，酯酶-脂肪酶(C-8)，脂肪酶(C-14)，亮氨酸芳基酰胺酶，缬氨酸芳基酰胺酶，酸性磷酸酶，磷酸水解酶，α-葡糖苷酶和β-葡糖苷酶。DK1-SA11菌株在模拟胃肠环境中抗性的研究结果表明，该菌株在pH2.5，4h后活菌数目仍没有明显的下降，在共轭胆汁牛磺脱氧胆酸和胆汁盐条件下最低抑菌浓度分别为≥1.0mmol/L和0.25mmol/L。另外，该菌株不编码溶菌素BL、肠毒素及非溶血肠毒素，也不含有entFM,bceT,cytK,Nhe和Hbl毒力基因。菌株不具有溶血活性，不含有编码磷酸酯酶的基因。另外，该菌株对欧洲食品安全标准中活菌应用于动物或人类时的规定条例中列出的所有抗生素都非常的敏感。急性和慢性毒理学试验结果表明小鼠没有死亡现象，对健康没有任何影响。口服DK1-SA11菌株达到半数致死量（LD50）为2×1011cfu。采用斑马鱼进行急性毒性试验，结果表明该菌株没有对斑马鱼产生明显的毒性，半数致死浓度（LC50）>108cfu.mL-1。本论文测定了不同的培养条件对DK1-SA11菌株的影响，结果显示商品化的2216E培养基最有利于该株细菌的培养和抑菌产物的生成，最佳培养条件为25°C，pH7.0，180rpm振荡培养60~72小时。49种不同的碳水化合物中，D-甘露糖提高了菌株33.3%的抑菌活性，D-阿拉伯醇将菌株的抑菌活性降低了44.4%。-20°C条件下保存三个月后，粗酶制剂仍有较高的抑菌活性，煮沸10min后仍保留全部的活性，然而经胰蛋白酶，脂蛋白酶和木瓜蛋白酶处理后失活。利用丁醇萃取法获得高浓度的DK1-SA11菌株产生的抑菌混合物。采用薄层层析法、高效液相色谱法和质谱法分析抑菌混合物的成分，结果显示DK1-SA11菌株能够合成表面活性素、伊枯草菌素和丰原素。综上所述，DK1-SA11菌株是一株新的海洋芽孢杆菌，能够合成多种具有宽抑菌效果的化合物，具有用来制备抑菌剂的潜力。
【作者】MuhammadNaseemKhan；
【导师】林洪；王静雪；
【作者基本信息】中国海洋大学，食品科学，2014，博士
【关键词】海洋细菌；宽抑菌谱；拮抗；益生菌；枯草芽孢杆菌斯皮兹仁亚种；

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