β-环糊精葡萄糖基转移酶在枯草杆菌中的分泌表达及其热稳定性研究

【摘要】随着环糊精在食品、医药、化妆品等领域的应用越来越广，其生产所必需的环糊精葡萄糖基转移酶(EC2.4.1.19，简称CGT酶)已成为了研究的热点。为了克服天然菌产CGT酶能力低下这一缺陷，通过构建基因工程菌实现酶的胞外过量表达是行之有效的途径之一。目前，通常采用大肠杆菌(Escherichiacoli)进行CGT酶的过量表达，但CGT酶在E.coli中易形成不溶性包涵体，严重限制了其工业应用。此外，大部分来源的CGT酶热稳定性相对较低，不利于在环糊精生产中应用，因此，有必要着力改善CGT酶的热稳定性。本论文主要构建了来源于环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)STB01的-CGT酶在枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中的胞外表达体系，同时对该酶的热稳定性进行了系统研究。主要研究结果如下：(1)将来源于B.circulansSTB01的cgt基因插入质粒pST中，成功构建了分泌型表达载体cgt/pST，将其转化表达宿主B.subtilisWB600，实现了-CGT酶在B.subtilis中的胞外分泌表达。对摇瓶发酵产重组-CGT酶的条件进行了优化，结果表明，对数中期(种龄为14h)的种子最有利于发酵产酶；当发酵培养基为TB、pH为7.0时，37℃培养48h后胞外酶活力达到27.9U/mL，与天然菌株B.circulansSTB01在较优发酵条件下所分泌的胞外酶活力相比，提高了近19倍；对TB培养基碳源、氮源进一步优化，以6g/L的玉米淀粉替代TB培养基中的甘油，以30g/L的酵母提取物作为氮源，胞外酶活可达到31.2U/mL；亮氨酸、天冬氨酸的添加能明显促进β-CGT酶的胞外表达，而0.5mMFe3+的添加能进一步将胞外酶活提高到36.9U/mL。这是目前报道的β-CGT酶在B.subtilis中胞外表达的最高β-环化活力。(2)采用PhenylHP柱疏水层析、Q-HP柱阴离子交换层析两步能很好的对重组β-CGT酶进行纯化，酶的回收率达到45.3%。重组β-CGT酶的表观分子量约为76.5kDa，且分子量呈单分散，说明酶蛋白分子在溶液中是以单聚体形式存在。该酶的最适pH为6.5，且在甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中体现出更好的热稳定性；最适温度为60℃，45℃、50℃、55℃和60℃下的半衰期分别为6.8h、4.5h、55.6min和6.5min；60℃下的热稳定性随酶浓度的升高而增大。该酶的活性不依赖于金属离子，1mMLi+、Mg2+、Zn2+和Hg2+对该酶的β-环化活力有抑制作用，而1mMCa2+和Ba2+能明显激活酶的β-环化活力，激活程度分别为10.4%和15.5%。在酶催化反应的整个过程中，其主要产物均为β-环糊精。以玉米淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉为底物时，该酶环化反应的动力学性质不符合米氏方程；而分别以可溶性淀粉、麦芽糊精(DE5、15、25)为底物时，其环化反应的动力学性质能用米氏方程很好的进行描述。(3)钙离子对CGT酶的环化活力和热稳定性有一定的提高作用。对于β-环化活力，1mMCa2+对来源于B.circulansSTB01的β-CGT酶的激活效应最强，酶活提高了10.4%，而5mMCa2+对来源于PaenibacillusmaceransJFB05-01的α-CGT酶的激活效应最强，酶活提高了近15%。然而，钙离子对两种不同来源的CGT酶热稳定性的影响效果存在明显差异，相比而言，钙离子对β-CGT酶热稳定性的整体提高效果明显高于其对α-CGT酶的影响；同时，在提高CGT酶热稳定性的情况下，两种酶的热稳定性对钙离子浓度的响应也存在差别，0.5mMCa2+对α-CGT酶热稳定性的提高效果最好，能将α-CGT酶60℃时的半衰期延长5.5倍；而5mMCa2+对β-CGT酶热稳定性的提高效果最好，60℃保温120min后仍能保持原有酶活的88.3%。NanoDSC分析结果显示，β-CGT酶的热失活是不可逆的过程，且符合经典的两步热失活机制，能用TwoStateScaled模型较好的描述；0.5~10mMCa2+能将β-CGT酶的Tm值提高1.5~2℃，摩尔热容Cp提高2.8%~27.6%。通过比较α-CGT酶和β-CGT酶的晶体结构发现，β-CGT酶较α-CGT酶多一个钙离子结合位点CaⅢ。将β-CGT酶CaⅢ结合位点上的氨基酸Ala315和Asp577分别突变成与之相对应的α-CGT酶的氨基酸Asp和Lys，构建了A315D和D577K单突变体。结果显示，A315D和D577K的突变均能提高β-CGT酶的热稳定性，能将原始酶60℃下的半衰期分别提高约80%和130%。进一步分析钙离子对A315D和D577K热稳定性的影响发现，不同浓度的钙离子对两种突变体的热稳定性均有所提高，而对A315D的整体提高效果明显优于D577K。对A315D而言，提高热稳定性的最适钙离子浓度由野生型酶的5mM降低至1.5mM，60℃保温120min后仍能保持原有酶活的86.3%；而0.5mMCa2+对D577K热稳定性的提高效果最好，60℃保温120min后仍能保持原有酶活的56.3%。说明CGT酶的热稳定性及其对钙离子的响应与钙离子结合位点CaⅢ密切相关。(4)Asp577饱和突变对β-CGT酶热稳定性的影响存在明显差异，极性亲水性氨基酸残基或带电荷氨基酸残基的突变普遍较非极性疏水性氨基酸残基的突变更能提高酶的热稳定性。55℃和60℃时半衰期的相关性分析结果显示，能将野生和突变β-CGT酶分成3组，第一组对酶的热稳定性影响不大，包括D577I、D577W、D577A、D577L、D577V、D577C和D577S；第二组能比较显著的提高酶的热稳定性，包括D577E、D577F、D577Q、D577M和D577H，能将酶55℃和60℃时的半衰期延长35%~65%；第三组能显著提高酶的热稳定性，包括D577P、D577R、D577T、D577K、D577N、D577Y和D577G，能将酶60℃时的半衰期延长2.1~2.4倍，D577G的作用效果最好。机理分析显示，Asp577残基位于β-CGT酶D域的外围，与A域紧密相邻，其极性亲水性氨基酸残基或带电荷氨基酸残基的突变可能能够增强该位点与附近氨基酸残基的氢键、静电相互作用或离子键相互作用的形成，增加酶空间结构的稳定，进而提高酶的热稳定性。(5)不同分子量聚乙二醇(PEG)均能不同程度的激活β-CGT酶和提高其热稳定性，10%~15%PEG400激活程度最大，达20%。低分子量PEG(PEG400、PEG1000)对β-CGT酶热稳定性的提高效果明显高于其他高分子量PEG，其中又以PEG1000提高效果最好，并且提高效果随添加浓度的增加而增加，15%PEG1000能将β-CGT酶60℃下的半衰期延长约6.5倍。在10%PEG1000的基础上，协同添加0.05%纳米硅溶胶能进一步提高β-CGT酶的热稳定性，60℃保温60min后仍能保留61.3%的酶活，比单独添加15%PEG1000高出31.6%；而单独添加纳米硅溶胶时，对酶的热稳定性几乎没有作用。机理分析显示，PEG能够增加酶蛋白分子的表面疏水性，有效保护酶的二级结构，进而保护酶的三级空间结构；纳米硅溶胶能够协助PEG1000形成类似凝胶状网络结构，降低酶蛋白分子在受热过程中的聚集，进而提高酶的热稳定性。
【作者】李才明；
【导师】顾正彪；
【作者基本信息】江南大学，食品科学，2014，博士
【关键词】环糊精葡萄糖基转移酶；枯草杆菌；分泌表达；热稳定性；钙离子结合位点；

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